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实验目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,给社会造成了严重的负担。因此探讨肝癌发生的分子机制对于降低肝癌死亡率具有重要的意义。细胞程序性死亡-配体1（Programmed cell death ligand 1,PD-L1）也称为表面抗原分化簇274（Cluster of differentiation 274,CD274）或B7同源体（B7homolog 1,B7-H1）,由CD274基因编码。PD-L1在肝癌细胞中的高表达通常会抑制T细胞的增殖和功能,导致肿瘤微环境中的免疫抑制。然而,关于PD-L1在HCC细胞中过表达的机制鲜有报道。本课题通过诠释PD-L1在肝癌细胞中发生上调的转录调控机制,为肝细胞癌的治疗提供新的治疗策略。实验方法:1、EGF孵育肝癌细胞后,采用Real time PCR、Western blot实验检测PD-L1 mRNA、蛋白的表达情况;采用ELISA实验检测培养基中PD-L1的含量。2、给予EGF孵育基因敲减EGFR的肝癌细胞系,采用Real time PCR和Western blot实验检测PD-L1的表达情况;在EGF孵育肝癌细胞系时先给予EGFR抑制剂Gefitinib,然后采用Real time PCR和Western blot实验检测PD-L1的表达。3、给予EGF孵育肝癌细胞,采用Western blot实验检测p-PKM2的表达情况。采用EGF与EGFR抑制剂Gefitinib共同孵育肝癌细胞,提取细胞总蛋白,采用Western blot实验检测p-PKM2的表达情况;提取核蛋白,采用Western blot实验检测PKM2核蛋白的表达;采用免疫荧光实验检测PKM2在细胞中的定位。4、采用EGF孵育基因敲减PKM2的肝癌细胞,采用Real time PCR和Western blot实验检测PD-L1的表达情况。在肝癌细胞中过表达PKM2-WT、PKM2 S37A突变体（非磷酸化）、PKM2 S37D突变体（模拟磷酸化）,采用Real time PCR和Western blot实验检测PD-L1 mRNA和蛋白的表达情况;采用染色质免疫共沉淀技术检测PKM2突变体与PD-L1启动子区结合情况。5、给予EGF孵育肝癌细胞,采用Western blot实验检测组蛋白H3 Thr11位点的磷酸化情况。采用EGF与EGFR抑制剂Gefitinib、PKM2抑制剂Shikonin共同孵育肝癌细胞,提取细胞总蛋白,采用Western blot实验检测p-H3的表达情况。在肝癌细胞中过表达PKM2-WT、PKM2 S37A突变体（非磷酸化）、PKM2 S37D突变体（模拟磷酸化）,采用Western blot实验检测p-H3的表达情况。在敲减内源性H3的肝癌细胞中过表达H3-WT或H3 T11A突变体,然后给予EGF孵育上述细胞,采用Real time PCR和Western blot实验检测PD-L1的表达情况;给予EGF孵育肝癌细胞,采用染色质免疫共沉淀实验检测H3与PD-L1启动子的结合情况。6、腹腔注射二乙基亚硝胺（DEN）建立大鼠肝癌模型,采用Western blot实验检测p-EGFR、PKM2、p-H3和PD-L1的表达情况;采用Real time PCR实验检测PD-L1 mRNA的表达情况,采用染色质免疫共沉淀实验检测p-H3-T11在PD-L1启动子区的富集情况。7、采用小鼠肝癌H22细胞建立皮下移植瘤模型,分别给予EGFR抑制剂Gefitinib和PKM2抑制剂Shikonin,然后剥离肿瘤,并称取重量;采用免疫组织化学染色法检测PD-L1和CD8+的表达情况。实验结果:1、在Hep G2、Huh-7、SNU-368、SNU-739四种肝癌细胞中,EGF可显著促进PD-L1mRNA和蛋白的表达;ELISA实验结果显示EGF可上调细胞培养基中PD-L1的含量。2、在肝癌细胞中,基因敲减EGFR或给予EGFR抑制剂Gefitinib均可显著抑制EGF介导的PD-L1 mRNA和蛋白的上调。3、EGF可促进PKM2 Ser37位点发生磷酸化以及PKM2的核转位,而EGFR抑制剂Gefitinib可显著逆转EGF介导的PKM2 Ser37位点的磷酸化以及PKM2的核移位。4、在肝癌细胞中基因敲减PKM2可显著逆转EGF介导的PD-L1 mRNA和蛋白水平的上调;转染PKM2 S37D突变体（模拟磷酸化）至肝癌细胞中可显著上调PD-L1mRNA和蛋白的表达。且ChIP实验显示PKM2 Ser37在PD-L1启动子区域的募集增强。5、EGF可显著上调肝癌细胞中组蛋白H3的磷酸化表达;而EGFR抑制剂Gefitinib、PKM2抑制剂Shikonin则可显著抑制EGF诱导的组蛋白H3 Thr11的磷酸化。在肝癌细胞中过表达PKM2 S37D突变体（模拟磷酸化）,则组蛋白H3 Thr11位点的磷酸化也显著上调。在内源性敲减组蛋白H3的肝癌细胞中过表达H3 T11A突变体,然后给予EGF孵育上述细胞,则EGF对PD-L1 mRNA和蛋白的上调作用显著受到抑制。给予EGF孵育SNU-368细胞,则ChIP实验显示H3 Thr11在PD-L1启动子区域的募集增强。6、在DEN诱导的肝癌大鼠模型中,肝癌组织中p-EGFR、PKM2、p-H3蛋白的表达上调,PD-L1 mRNA和蛋白的表达上调,且ChIP实验显示H3 Thr11在PD-L1启动子区域的募集增强。7、皮下移植瘤模型显示,EGFR抑制剂Gefitinib、PKM2抑制剂Shikonin均能抑制肿瘤生长,免疫组织化学染色显示EGFR抑制剂Gefitinib和PKM2抑制剂Shikonin均能抑制肿瘤组织中PD-L1蛋白的表达,上调组织中CD8+细胞比例。实验结论:EGF可以诱导肝癌细胞中PKM2 Ser37位点发生磷酸化并促进其转位至细胞核中,细胞核中的PKM2进而磷酸化组蛋白H3 Thr11位点,改变染色质结构,导致PD-L1转录表达,从而促进肝癌的发生和发展。