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先天性白内障是指在胚胎发育过程中由于多种因素导致的晶状体形态或功能发育异常，具有显著的临床和遗传异质性，临床表现多种多样且致病基因众多，对其进行精准高效的遗传学筛查显得尤为必要。目标区域外显子捕获测序技术能够有效筛查先天性白内障的致病基因，是快速有效地发现遗传性疾病的检测方法。本课题收集了一个先天性白内障大家系的信息和血样，应用目标区域外显子捕获测序筛查白内障致病基因，分析突变位点的生物信息学特征，寻找到位于GJA3基因上一个新的致病突变GJA3/p.T148I。根据目的基因GJA3的野生型和突变型序列，成功构建了表达载体和稳定转染细胞系，最后对GJA3/p.T148I突变进行致病的分子机制研究。该家系中GJA3/p.T148I新致病突变的发现，不仅扩展了GJA3致病位点的图谱和发病机制，也为目标区域外显子捕获测序技术在先天性白内障遗传学诊断中的应用提供了可靠依据。
第一部分 一个先天性白内障家系致病基因筛查
目的：先天性白内障的遗传方式多样，并以常染色体显性遗传先天性白内障最为常见。分子遗传学技术的进步加快了白内障致病基因研究的进展，迄今为止共发现了70个与之相关的致病基因或候选位点。本部分的研究拟对一个来自福建厦门地区的常染色体显性遗传先天性白内障家系进行致病基因筛查，明确导致其白内障的致病基因。
方法：研究对象来自在福建医科大学附属第一医院眼科中心诊治过的一个先天性白内障家系，对所有入组的患者和家系其他成员进行详细的病史采集和临床检查。详尽调查了所有家系成员的健康状况和家庭成员关系，完善了眼科专科体检和全身一般体格检查，详细记录成员的病史和眼部临床表型。根据家系成员病史及体检情况绘制成家系图谱，以此确定其遗传模式和进行遗传学分析。高质量提取入组家系成员的外周血DNA，构建高通量基因组测序文库，对先天性白内障的相关致病基因的外显子及相邻内含子区域进行目标区域外显子捕获与富集，利用IlluminaNext Seq500高通量测序仪对其进行测序并分析结果。
结果：该家系现存四代成员，共收集到34位家系成员的临床资料，其中有5位先天性白内障患者，29位正常表型的家庭成员，符合常染色体显性遗传先天性白内障的遗传特征。先证者同其它家系成员疾病的表型均为双眼绕核性粉尘状白内障。对该家系的高通量测序结果的数据量和深度均符合进一步生物信息学分析的要求，可用于后续分析基因突变的位点。
结论：本研究收集了一个来自福建省的先天性白内障家系，晶状体表现为粉尘状绕核性混浊，对该家系先证者和家系成员进行了目标区域外显子捕获测序，其中包含了134个与先天性白内障发病相关的基因，测序结果可用于后续分析疾病的基因突变和致病机制。
第二部分 致病基因鉴定、生物信息学分析和载体构建
目的：对家系成员的测序结果进行分析，结合Sanger测序验证其致病突变位点，并以此构建体外真核细胞的表达载体，用于探讨突变致病的分子机制。
方法：测序结果中筛选出的高质量数据以人类基因组为参考序列，进行突变位点的比对，用BWA和GATK软件找出其中的SNP和InDel突变位点，并与突变数据库比对进行注释。对初步筛查出的候选位点进行Sanger测序验证，应用DNAMAN软件在家系中进行共分离分析。对发现的GJA3/p.T148I突变，进行致病性预测、疏水性评价和蛋白质同源建模等分析。通过DNA克隆和重组的方法，构建含有Cx46/EGFP和Cx46/Flag序列的野生型和突变型表达载体。
结果：该突变位于GJA3基因第443位碱基，使原有位点上的胞嘧啶C转换为胸腺嘧啶T（c.443，ACC→ATC），在此家系中呈现共分离的状态。GJA3/p.T148I位点的PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster氨基酸改变预测结果均提示该突变有致病性。疏水性评价结果显示：GJA3/p.T148I突变蛋白的CL区域的疏水性较野生型有明显升高。同源建模结果显示：GJA3/p.T148I突变蛋白的C端的α-螺旋结构缺失。构建质粒的模板来源于人类的GJA3序列，在插入EGFP和Flag等序列后，成功构建了pEGFP-N1-Cx46-WT、pEGFP-N1-Cx46-T148I、pEGFP-N1-Cx46-G143R、pSin-Cx46/Flag-WT和pSin-Cx46/Flag-T148I等真核细胞表达载体，用于后续的致病分子机制研究。
结论：在该家系中发现了先天性白内障新的致病突变位点GJA3/p.T148I，致病性预测、疏水性评价和同源建模等分析结果均提示该突变有致病性。以GJA3野生型序列为模板，成功构建了细胞表达的质粒用以进一步分析该突变致病的分子机制。
第三部分 GJA3/p.T148I基因突变的分子机制研究
目的：将成功构建的真核细胞表达载体转染入HLEC和HEK-293细胞内，分析细胞增殖、相关蛋白表达量和缝隙连接通道功能的改变，研究GJA3/p.T148I基因突变的分子机制。
方法：将pEGFP-N1-Cx46-WT、pEGFP-N1-Cx46-T148I、pSin-Cx46/Flag-WT、pSin-Cx46/Flag-T148I和pEGFP-N1-Cx46-G143R等真核细胞表达载体转染HLEC和HEK-293后，使用倒置荧光显微镜观察目的蛋白在细胞内的定位和Cx46缝隙连接通道的形成。构建HEK-293稳转细胞系，用于检测缝隙连接半通道功能和缝隙连接蛋白的表达量，并使用CCK-8检测细胞增殖活性。H2O2诱导HLEC细胞和HEK-293稳定转染细胞系的氧化损伤，应用AnnexinV-FITC/PI研究细胞凋亡，检测MAPK通路相关蛋白的改变。
结果：GJA3/p.T148I能影响Cx46蛋白的细胞内定位，使其在胞内异常聚集，并且可以显著增加Cx46蛋白表达，但Cx43的表达量并未受到影响。GJA3/p.T148I可以形成缝隙连接通道，但其减弱了Cx46的缝隙连接半通道功能，且加速了细胞增殖活性。氧化损伤可以诱导HLEC的GJA3基因表达下调，并且GJA3/p.T148I突变不仅能够诱导细胞凋亡和减弱细胞抵抗氧化损伤的能力，而且可以导致MAPK通路在细胞中出现异常表达。
结论：在基因突变的功能研究中，GJA3/p.T148I突变不仅可以导致Cx46蛋白高表达并异常聚集于胞内，也可以减弱Cx46的通道功能、加速细胞增殖活性、诱导细胞凋亡和减弱细胞抵抗氧化损伤的能力等途径，导致先天性白内障的发生。GJA3/p.T148I新致病突变的发现，不仅扩充了该基因致病位点的突变图谱和发病机制，也进一步证实了缝隙连接通道蛋白功能改变和细胞凋亡参与先天性白内障致病的分子机制。
第一部分 一个先天性白内障家系致病基因筛查
目的：先天性白内障的遗传方式多样，并以常染色体显性遗传先天性白内障最为常见。分子遗传学技术的进步加快了白内障致病基因研究的进展，迄今为止共发现了70个与之相关的致病基因或候选位点。本部分的研究拟对一个来自福建厦门地区的常染色体显性遗传先天性白内障家系进行致病基因筛查，明确导致其白内障的致病基因。
方法：研究对象来自在福建医科大学附属第一医院眼科中心诊治过的一个先天性白内障家系，对所有入组的患者和家系其他成员进行详细的病史采集和临床检查。详尽调查了所有家系成员的健康状况和家庭成员关系，完善了眼科专科体检和全身一般体格检查，详细记录成员的病史和眼部临床表型。根据家系成员病史及体检情况绘制成家系图谱，以此确定其遗传模式和进行遗传学分析。高质量提取入组家系成员的外周血DNA，构建高通量基因组测序文库，对先天性白内障的相关致病基因的外显子及相邻内含子区域进行目标区域外显子捕获与富集，利用IlluminaNext Seq500高通量测序仪对其进行测序并分析结果。
结果：该家系现存四代成员，共收集到34位家系成员的临床资料，其中有5位先天性白内障患者，29位正常表型的家庭成员，符合常染色体显性遗传先天性白内障的遗传特征。先证者同其它家系成员疾病的表型均为双眼绕核性粉尘状白内障。对该家系的高通量测序结果的数据量和深度均符合进一步生物信息学分析的要求，可用于后续分析基因突变的位点。
结论：本研究收集了一个来自福建省的先天性白内障家系，晶状体表现为粉尘状绕核性混浊，对该家系先证者和家系成员进行了目标区域外显子捕获测序，其中包含了134个与先天性白内障发病相关的基因，测序结果可用于后续分析疾病的基因突变和致病机制。
第二部分 致病基因鉴定、生物信息学分析和载体构建
目的：对家系成员的测序结果进行分析，结合Sanger测序验证其致病突变位点，并以此构建体外真核细胞的表达载体，用于探讨突变致病的分子机制。
方法：测序结果中筛选出的高质量数据以人类基因组为参考序列，进行突变位点的比对，用BWA和GATK软件找出其中的SNP和InDel突变位点，并与突变数据库比对进行注释。对初步筛查出的候选位点进行Sanger测序验证，应用DNAMAN软件在家系中进行共分离分析。对发现的GJA3/p.T148I突变，进行致病性预测、疏水性评价和蛋白质同源建模等分析。通过DNA克隆和重组的方法，构建含有Cx46/EGFP和Cx46/Flag序列的野生型和突变型表达载体。
结果：该突变位于GJA3基因第443位碱基，使原有位点上的胞嘧啶C转换为胸腺嘧啶T（c.443，ACC→ATC），在此家系中呈现共分离的状态。GJA3/p.T148I位点的PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster氨基酸改变预测结果均提示该突变有致病性。疏水性评价结果显示：GJA3/p.T148I突变蛋白的CL区域的疏水性较野生型有明显升高。同源建模结果显示：GJA3/p.T148I突变蛋白的C端的α-螺旋结构缺失。构建质粒的模板来源于人类的GJA3序列，在插入EGFP和Flag等序列后，成功构建了pEGFP-N1-Cx46-WT、pEGFP-N1-Cx46-T148I、pEGFP-N1-Cx46-G143R、pSin-Cx46/Flag-WT和pSin-Cx46/Flag-T148I等真核细胞表达载体，用于后续的致病分子机制研究。
结论：在该家系中发现了先天性白内障新的致病突变位点GJA3/p.T148I，致病性预测、疏水性评价和同源建模等分析结果均提示该突变有致病性。以GJA3野生型序列为模板，成功构建了细胞表达的质粒用以进一步分析该突变致病的分子机制。
第三部分 GJA3/p.T148I基因突变的分子机制研究
目的：将成功构建的真核细胞表达载体转染入HLEC和HEK-293细胞内，分析细胞增殖、相关蛋白表达量和缝隙连接通道功能的改变，研究GJA3/p.T148I基因突变的分子机制。
方法：将pEGFP-N1-Cx46-WT、pEGFP-N1-Cx46-T148I、pSin-Cx46/Flag-WT、pSin-Cx46/Flag-T148I和pEGFP-N1-Cx46-G143R等真核细胞表达载体转染HLEC和HEK-293后，使用倒置荧光显微镜观察目的蛋白在细胞内的定位和Cx46缝隙连接通道的形成。构建HEK-293稳转细胞系，用于检测缝隙连接半通道功能和缝隙连接蛋白的表达量，并使用CCK-8检测细胞增殖活性。H2O2诱导HLEC细胞和HEK-293稳定转染细胞系的氧化损伤，应用AnnexinV-FITC/PI研究细胞凋亡，检测MAPK通路相关蛋白的改变。
结果：GJA3/p.T148I能影响Cx46蛋白的细胞内定位，使其在胞内异常聚集，并且可以显著增加Cx46蛋白表达，但Cx43的表达量并未受到影响。GJA3/p.T148I可以形成缝隙连接通道，但其减弱了Cx46的缝隙连接半通道功能，且加速了细胞增殖活性。氧化损伤可以诱导HLEC的GJA3基因表达下调，并且GJA3/p.T148I突变不仅能够诱导细胞凋亡和减弱细胞抵抗氧化损伤的能力，而且可以导致MAPK通路在细胞中出现异常表达。
结论：在基因突变的功能研究中，GJA3/p.T148I突变不仅可以导致Cx46蛋白高表达并异常聚集于胞内，也可以减弱Cx46的通道功能、加速细胞增殖活性、诱导细胞凋亡和减弱细胞抵抗氧化损伤的能力等途径，导致先天性白内障的发生。GJA3/p.T148I新致病突变的发现，不仅扩充了该基因致病位点的突变图谱和发病机制，也进一步证实了缝隙连接通道蛋白功能改变和细胞凋亡参与先天性白内障致病的分子机制。