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甲状腺癌（thyroid carcinoma,TC）在甲状腺恶性肿瘤中最为常见，在全身恶性肿瘤中所占比率约为1%。TC的病理类型可以分为四种，分别是乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌及髓样癌。但近年来TC的发病率呈现逐年攀升趋势，近30年以来，TC发病率已经升高接近3倍，2015年中国新发TC发病率达到90例/10万人，并且晚期难治性TC患者数量亦呈现逐年增多趋势。
乳头状甲状腺癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是TC中比例最高的一种病理学类型，大约占所有TC患者的85%~90%。任何年龄均可发病，多见于儿童或者年轻（40岁前）女性，男女发病比例为1：（2～4）。
目前临床上对PTC的诊断工具主要是影像学检查（超声、CT和MRI）和细胞学检查。虽然手术切除是治疗PTC的首选治疗方案，但是如果PTC患者没有能够在早期进行确诊和干预，也可能会因肿瘤局部侵犯或肿瘤远处转移而错失治疗良机，导致不良的预后，早期诊断对于PTC患者的预后具有重要意义。
然而PTC的早期诊断仅仅靠单纯的病理形态学检查比较困难，往往需结合分子生物学的检查，其中肿瘤标记物（tumor marker,TM）的辅助检查将会显著提高PTC的早期诊断率。TM包括多种酶类﹑激素类﹑蛋白质及多种其他代谢产物等，主要是由多种恶性肿瘤细胞合成分泌后，释放进入体液的生物活性类物质，因此，TM的动态变化与恶性肿瘤息息相关。灵敏度高和特异性强的TM能够对PTC高发区的高危人群进行PTC的早期诊断、早期筛查、预后评判及治疗监测等干预措施，能够显著降低PTC的病死率。因此，寻找灵敏度高和特异性强的可以应于PTC早期诊断的TM将具有非常重要的意义。
虽然国内外学者曾经对PTC早期诊断相关的肿瘤标记物进行过大量的研究工作，并且有多种TM已经在医院的临床实践中得到初步应用。有关PTC患者的早期诊断和预后评判，有相关研究报道的TM包括：甲状腺球蛋白（TG）、间皮瘤相关抗体-1（HBME-1）、线粒体ATP酶合成体?亚基（ATP5E）、环氧化酶-2（COX-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）、角蛋白19（CK19）、半乳糖凝集素-3（LGALS3）和转染重排基因（RET）等，另外，BRAF V600E基因突变作为PTC典型的DNA突变标志物，已在临床普遍应用于PTC的术前诊断和预后评估。但是，灵敏度和特异性均比较理想的PTC早期诊断的TM尚未被发现，仍然值得进一步的探索和验证。
血浆是一种机体内十分重要的体液。血浆中的差异蛋白质组可以反映肿瘤早期机体中蛋白质成分的变化，而且血浆样品采集更为方便、极小的创伤、痛苦更少，具有临床应用便捷的优势，因此，从血浆中筛选潜在的TM必将为肿瘤的早期诊断和早期筛查带来新希望。但是由于血浆中存在白蛋白和球蛋白等高丰度蛋白的干扰问题，显著增加了研究人员从血浆中找到TM的难度。
外泌体（exosome）主要由多种活细胞合成并分泌的一种直径大约在40-100nm的细胞外纳米级小囊泡，具有脂质双层膜结构。外泌体由于携带细胞特异性信号分子，例如多种蛋白质、脂质及核酸等，可以作为细胞信号分子传递给其他细胞，从而影响受体细胞的生物学功能。通过对肿瘤来源的血浆外泌体进行分析研究，可以从一个全新的角度加深对肿瘤的进展与转移等病理生理机制的认识，同时可以有助于发现肿瘤早期诊断相关的TM。与传统的诊断方法相比较，筛选出的肿瘤患者血液外泌体来源的TM，可能会灵敏度更高，特异性更强，将成为一个新的肿瘤的早期诊断和治疗的途径，从而为甲状腺癌患者带来早发现早治疗的希望。
恶性肿瘤是一种系统性疾病，必然伴随着多种肿瘤相关基因或蛋白质表达调控的改变。“后基因组时代”肿瘤学研究的重点研究对象之一是研究肿瘤相关基因的表达调控和表达产物及其生物学功能。由于蛋白质组学研究技术的不断革新和进步，差异蛋白质组学技术已经成为21世纪生命科学研究的重要方法。
随着蛋白质组学技术不断的发展和完善，其解析能力也在逐步提升，为生命科学研究提供更加强大的平台和工具。目前最常用的蛋白质组学技术平台主要是双向凝胶电泳技术（2DE）、荧光差异电泳技术（DIGE）、细胞培养条件下稳定同位素标记技术（SILAC）、同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）、蛋白质非标记定量技术（label-free）等。label-free技术是采用液相色谱和质谱联用的方法分离鉴定蛋白质，通过一级质谱峰的峰强度和峰面积进行蛋白质的定量，利用二级质谱峰的信息来进行蛋白质定性。由于label-free技术无需标记、操作简单和不受比较样品数的限制等优势，已经大量的应用在疾病差异蛋白质组学研究中。
本研究拟通过label-free差异蛋白组学平台对PTC组与健康对照组（N组）的血浆外泌体蛋白质组进行分离，并对两组间的差异蛋白质组进行生物信息学分析，筛选出与PTC早期诊断相关的潜在TM，最后，通过设计实验对候选蛋白质进行功能验证，进而筛选出PTC相关的血浆外泌体肿瘤标记物。
目的：
筛选并鉴定PTC早期诊断用的血浆外泌体肿瘤标记物。
方法：
1.临床标本的收集与保存
86例PTC血浆标本库均取自2017年6月-2018年3月郑州大学第一附属医院甲状腺外科的住院患者，并且所有入选患者均未接受手术治疗及放化疗等其他治疗方式，其中男性患者32例，女性患者54例，年龄分布在30-52岁之间，肿瘤TNM分期均为T1N0M0。90例对照组血浆标本库均取自2018年1月-3月郑州大学第一附属医院健康管理中心的健康体检者，男性42例，女性48例，年龄28-45岁。本实验已经报备郑州大学第一附属医院伦理委员会并同意实施，并且受试者均已经签署了实验知情同意书。血浆收集及实验处理步骤：每例患者取2ml抗凝全血，4℃，1000g离心10min，收集血浆上清，分装后置于-80℃冰箱中冻存备用。
2.血浆外泌体的分离与鉴定
采用超速离心法进行血浆外泌体分离，利用透射电镜（TEM）、Nanosight颗粒粒度分析仪和Western blot对血浆外泌体进行鉴定。
3.血浆外泌体蛋白的裂解提取
低温下按1∶10比例加入蛋白质裂解液（8M尿素，含蛋白酶抑制剂）进行蛋白裂解。
4.蛋白质BCA法蛋白定量
利用BCA蛋白质定量试剂盒来测量血浆外泌体裂解样本的蛋白质浓度。
5.SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色
配制5%上胶和12%的下胶，电泳结束后，采用胶体考马斯亮蓝G-250染色的方法进行染色，利用Image Scanner白光扫描仪获取凝胶图像。
结果：
1.外泌体提取的鉴定结果
通过透射电镜观察，利用差速超速离心方法得到的血浆外泌体，外形呈圆盘状，纳米小囊泡直径在30-120nm之间，大小较均一，且背景清晰，杂质比较少。经Nanosight NS300和NTA软件进行分析，检测报告中显示MODE曲线线性流畅，外泌体直径大小较为集中，所含杂质少，粒径峰值为112nm，平均粒径为132±45nm，与血浆外泌体的理论大小值相符。Western blot结果能够清晰的观察到外泌体的标记物CD9和CD63蛋白条带，证明本实验成功提取出血浆外泌体。
2.质谱鉴定结果
利用高效液相色谱串联质谱仪对酶解样品进行分析后，通过搜索Uniprot数据库，共鉴定出278种蛋白质。本项目中主要通过比较PTC组和N组蛋白的表达比率（FC），显著差异表达蛋白的筛选标准为：FC＞1.50或FC＜-1.50。共筛选到89种差异蛋白，其中包括33个上调蛋白和56个下调蛋白
3.差异蛋白GO聚类分析
如果对89个差异蛋白按照差异蛋白的分子功能（MF）进行GO聚类分析，这些差异蛋白主要分子功能是结合活性和催化活性。如果按照差异蛋白的参与的生物学过程（BP）进行GO聚类分析，主要参与生物学调节、代谢过程、细胞过程和应激反应等。按照差异蛋白的细胞组分（CC）进行GO聚类分析，主要分布在细胞外区域，与本实验的外泌体成分相符合。
4.差异蛋白GO富集分析
上调的蛋白按照分子功能主要富集在结合活性。如果按照生物过程主要富集在运动迁移过程，如果按照细胞组分主要富集在亚细胞器。下调的蛋白按照分子功能主要富集在分子调节活性，如果按照生物学过程主要富集在生物学粘附过程，如果按照细胞组分则主要富集在膜组分。
5.差异蛋白KEGG通路可视化
利用KEGG在线数据库，按照蛋白参与的pathway通路或行使的功能分类，两两分组,针对组中的差异蛋白，选择N样本为对照，在KEGG pathway通路图上将差异蛋白显示出来，最后展示的是差异蛋白KEGG注释通路图。
结论：
1.共筛选出89种与PTC早期诊断相关的血浆外泌体差异蛋白，包括33个上调蛋白和56个下调蛋白，这些差异蛋白均有可能成为候选的血浆外泌体TM；
2.生物信息学分析发现，血浆外泌体差异蛋白可能与PTC肿瘤的病理生理过程密切相关；
3.IGHA2和PROZ有可能成为PTC潜在的血浆外泌体TM，对PTC的早期诊断和筛查具有重要参考价值，但是仍需要扩大样本量来确定其灵敏度和特异性。
乳头状甲状腺癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是TC中比例最高的一种病理学类型，大约占所有TC患者的85%~90%。任何年龄均可发病，多见于儿童或者年轻（40岁前）女性，男女发病比例为1：（2～4）。
目前临床上对PTC的诊断工具主要是影像学检查（超声、CT和MRI）和细胞学检查。虽然手术切除是治疗PTC的首选治疗方案，但是如果PTC患者没有能够在早期进行确诊和干预，也可能会因肿瘤局部侵犯或肿瘤远处转移而错失治疗良机，导致不良的预后，早期诊断对于PTC患者的预后具有重要意义。
然而PTC的早期诊断仅仅靠单纯的病理形态学检查比较困难，往往需结合分子生物学的检查，其中肿瘤标记物（tumor marker,TM）的辅助检查将会显著提高PTC的早期诊断率。TM包括多种酶类﹑激素类﹑蛋白质及多种其他代谢产物等，主要是由多种恶性肿瘤细胞合成分泌后，释放进入体液的生物活性类物质，因此，TM的动态变化与恶性肿瘤息息相关。灵敏度高和特异性强的TM能够对PTC高发区的高危人群进行PTC的早期诊断、早期筛查、预后评判及治疗监测等干预措施，能够显著降低PTC的病死率。因此，寻找灵敏度高和特异性强的可以应于PTC早期诊断的TM将具有非常重要的意义。
虽然国内外学者曾经对PTC早期诊断相关的肿瘤标记物进行过大量的研究工作，并且有多种TM已经在医院的临床实践中得到初步应用。有关PTC患者的早期诊断和预后评判，有相关研究报道的TM包括：甲状腺球蛋白（TG）、间皮瘤相关抗体-1（HBME-1）、线粒体ATP酶合成体?亚基（ATP5E）、环氧化酶-2（COX-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）、角蛋白19（CK19）、半乳糖凝集素-3（LGALS3）和转染重排基因（RET）等，另外，BRAF V600E基因突变作为PTC典型的DNA突变标志物，已在临床普遍应用于PTC的术前诊断和预后评估。但是，灵敏度和特异性均比较理想的PTC早期诊断的TM尚未被发现，仍然值得进一步的探索和验证。
血浆是一种机体内十分重要的体液。血浆中的差异蛋白质组可以反映肿瘤早期机体中蛋白质成分的变化，而且血浆样品采集更为方便、极小的创伤、痛苦更少，具有临床应用便捷的优势，因此，从血浆中筛选潜在的TM必将为肿瘤的早期诊断和早期筛查带来新希望。但是由于血浆中存在白蛋白和球蛋白等高丰度蛋白的干扰问题，显著增加了研究人员从血浆中找到TM的难度。
外泌体（exosome）主要由多种活细胞合成并分泌的一种直径大约在40-100nm的细胞外纳米级小囊泡，具有脂质双层膜结构。外泌体由于携带细胞特异性信号分子，例如多种蛋白质、脂质及核酸等，可以作为细胞信号分子传递给其他细胞，从而影响受体细胞的生物学功能。通过对肿瘤来源的血浆外泌体进行分析研究，可以从一个全新的角度加深对肿瘤的进展与转移等病理生理机制的认识，同时可以有助于发现肿瘤早期诊断相关的TM。与传统的诊断方法相比较，筛选出的肿瘤患者血液外泌体来源的TM，可能会灵敏度更高，特异性更强，将成为一个新的肿瘤的早期诊断和治疗的途径，从而为甲状腺癌患者带来早发现早治疗的希望。
恶性肿瘤是一种系统性疾病，必然伴随着多种肿瘤相关基因或蛋白质表达调控的改变。“后基因组时代”肿瘤学研究的重点研究对象之一是研究肿瘤相关基因的表达调控和表达产物及其生物学功能。由于蛋白质组学研究技术的不断革新和进步，差异蛋白质组学技术已经成为21世纪生命科学研究的重要方法。
随着蛋白质组学技术不断的发展和完善，其解析能力也在逐步提升，为生命科学研究提供更加强大的平台和工具。目前最常用的蛋白质组学技术平台主要是双向凝胶电泳技术（2DE）、荧光差异电泳技术（DIGE）、细胞培养条件下稳定同位素标记技术（SILAC）、同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）、蛋白质非标记定量技术（label-free）等。label-free技术是采用液相色谱和质谱联用的方法分离鉴定蛋白质，通过一级质谱峰的峰强度和峰面积进行蛋白质的定量，利用二级质谱峰的信息来进行蛋白质定性。由于label-free技术无需标记、操作简单和不受比较样品数的限制等优势，已经大量的应用在疾病差异蛋白质组学研究中。
本研究拟通过label-free差异蛋白组学平台对PTC组与健康对照组（N组）的血浆外泌体蛋白质组进行分离，并对两组间的差异蛋白质组进行生物信息学分析，筛选出与PTC早期诊断相关的潜在TM，最后，通过设计实验对候选蛋白质进行功能验证，进而筛选出PTC相关的血浆外泌体肿瘤标记物。
目的：
筛选并鉴定PTC早期诊断用的血浆外泌体肿瘤标记物。
方法：
1.临床标本的收集与保存
86例PTC血浆标本库均取自2017年6月-2018年3月郑州大学第一附属医院甲状腺外科的住院患者，并且所有入选患者均未接受手术治疗及放化疗等其他治疗方式，其中男性患者32例，女性患者54例，年龄分布在30-52岁之间，肿瘤TNM分期均为T1N0M0。90例对照组血浆标本库均取自2018年1月-3月郑州大学第一附属医院健康管理中心的健康体检者，男性42例，女性48例，年龄28-45岁。本实验已经报备郑州大学第一附属医院伦理委员会并同意实施，并且受试者均已经签署了实验知情同意书。血浆收集及实验处理步骤：每例患者取2ml抗凝全血，4℃，1000g离心10min，收集血浆上清，分装后置于-80℃冰箱中冻存备用。
2.血浆外泌体的分离与鉴定
采用超速离心法进行血浆外泌体分离，利用透射电镜（TEM）、Nanosight颗粒粒度分析仪和Western blot对血浆外泌体进行鉴定。
3.血浆外泌体蛋白的裂解提取
低温下按1∶10比例加入蛋白质裂解液（8M尿素，含蛋白酶抑制剂）进行蛋白裂解。
4.蛋白质BCA法蛋白定量
利用BCA蛋白质定量试剂盒来测量血浆外泌体裂解样本的蛋白质浓度。
5.SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色
配制5%上胶和12%的下胶，电泳结束后，采用胶体考马斯亮蓝G-250染色的方法进行染色，利用Image Scanner白光扫描仪获取凝胶图像。
结果：
1.外泌体提取的鉴定结果
通过透射电镜观察，利用差速超速离心方法得到的血浆外泌体，外形呈圆盘状，纳米小囊泡直径在30-120nm之间，大小较均一，且背景清晰，杂质比较少。经Nanosight NS300和NTA软件进行分析，检测报告中显示MODE曲线线性流畅，外泌体直径大小较为集中，所含杂质少，粒径峰值为112nm，平均粒径为132±45nm，与血浆外泌体的理论大小值相符。Western blot结果能够清晰的观察到外泌体的标记物CD9和CD63蛋白条带，证明本实验成功提取出血浆外泌体。
2.质谱鉴定结果
利用高效液相色谱串联质谱仪对酶解样品进行分析后，通过搜索Uniprot数据库，共鉴定出278种蛋白质。本项目中主要通过比较PTC组和N组蛋白的表达比率（FC），显著差异表达蛋白的筛选标准为：FC＞1.50或FC＜-1.50。共筛选到89种差异蛋白，其中包括33个上调蛋白和56个下调蛋白
3.差异蛋白GO聚类分析
如果对89个差异蛋白按照差异蛋白的分子功能（MF）进行GO聚类分析，这些差异蛋白主要分子功能是结合活性和催化活性。如果按照差异蛋白的参与的生物学过程（BP）进行GO聚类分析，主要参与生物学调节、代谢过程、细胞过程和应激反应等。按照差异蛋白的细胞组分（CC）进行GO聚类分析，主要分布在细胞外区域，与本实验的外泌体成分相符合。
4.差异蛋白GO富集分析
上调的蛋白按照分子功能主要富集在结合活性。如果按照生物过程主要富集在运动迁移过程，如果按照细胞组分主要富集在亚细胞器。下调的蛋白按照分子功能主要富集在分子调节活性，如果按照生物学过程主要富集在生物学粘附过程，如果按照细胞组分则主要富集在膜组分。
5.差异蛋白KEGG通路可视化
利用KEGG在线数据库，按照蛋白参与的pathway通路或行使的功能分类，两两分组,针对组中的差异蛋白，选择N样本为对照，在KEGG pathway通路图上将差异蛋白显示出来，最后展示的是差异蛋白KEGG注释通路图。
结论：
1.共筛选出89种与PTC早期诊断相关的血浆外泌体差异蛋白，包括33个上调蛋白和56个下调蛋白，这些差异蛋白均有可能成为候选的血浆外泌体TM；
2.生物信息学分析发现，血浆外泌体差异蛋白可能与PTC肿瘤的病理生理过程密切相关；
3.IGHA2和PROZ有可能成为PTC潜在的血浆外泌体TM，对PTC的早期诊断和筛查具有重要参考价值，但是仍需要扩大样本量来确定其灵敏度和特异性。