论文部分内容阅读
背景：耳聋是最常见的致残性疾病之一，可导致语言交流障碍，严重影响生存质量。在世界范围内，先天性耳聋患儿的出生率为1-3‰；我国每年有3万左右聋儿出生，其中大部分为重度、极重度感音神经性耳聋。耳聋病因复杂，有环境因素、遗传因素，或环境因素和遗传因素共同作用的结果。据文献报道，60%的耳聋患者为遗传因素所致。遗传性耳聋中，70%为非综合征型耳聋，30%为综合征型耳聋。非综合征型耳聋的相关基因很多、突变谱广，迄今为止，140多个非综合征性耳聋基因座已被定位，80多个基因已被克隆。国内聋病分子流行病学调查发现，常见的致病基因有GJB2、SLC26A4、GJB3、线粒体DNA12SrRNA基因等。基因诊断是目前诊断非综合征型耳聋的主要方法。近年来许多研究报道了悬浮阵列技术在基因检测中具有高通量、高重复性、操作简便等许多优点。此外，下一代测序技术的出现为遗传性耳聋带来了巨大的机遇。目标基因捕获结合高通量测序可以实现所有耳聋相关基因的一次性检测。本论文即基于悬浮阵列技术建立非综合征型耳聋4个常见基因GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体DNA12SrRNA基因的20个突变位点的一次性检测技术，实现耳聋热点突变的快速检测。利用悬浮阵列技术并结合目标基因捕获-高测序技术来探索非综合征型耳聋的基因诊断方案，更好地为这些患者提供遗传咨询及生育指导。
目的：基于悬浮阵列技术，建立一种可在单个反应体系中同时检测4个常见致聋基因、20个突变位点的快速分子诊断方法。利用建立的悬浮阵列技术结合目标基因捕获-高测序技术来探索非综合征型耳聋经济有效的基因诊断方案，更好地为这些患者提供遗传咨询及生育指导。
方法：1.选取1例经测序证实无基因突变的听力正常对照者、30例已知基因型患者的基因组DNA，建立耳聋悬浮阵列技术的检测平台，检测4个基因20个突变位点：GJB2基因：c.235delC，c.299-300delAT，c.109A＞G，c.176-191del16，c.35delG，c.512insAAGG；GJB3基因：c.538C＞T；SLC26A4基因：IVS7-2A＞G，c.2168C＞T，c.1229C＞T，c.1975G＞C，C.1226G＞A，c.2086C＞T，c.754T＞C，c.1174A＞T，IVS15+5G＞A，c.1693insA，c.2027T＞A；线粒体DNA12SrRNA基因：m.1555A＞G，m.1494C＞T。应用建立的悬浮阵列技术随机检测160例非综合征型耳聋患者标本，同时以临床常用的晶芯TM九项遗传性耳聋基因检测盒及Sanger测序对比实验。
2.收集2011年1月-2016年6月就诊于广东省妇幼保健院产前诊断中心及耳鼻喉专科门诊并临床拟诊为非综合征型耳聋患者标本共316例标本。我们对这些患者分三个步骤进行基因检测评估：第一步，首先采用新建立的悬浮阵列技术对患者进行4个常见基因20个突变热点的检测；第二步，对悬浮阵列技术检测到GJB2和SLC26A4基因单杂合突变的患者，采用Sanger测序对GJB2和SLC26A4基因进行测序，寻找该基因的另一致病突变。第三步，经悬浮阵列技术检测和Sanger测序均未能确诊的患者，采用目标序列捕获-高通量测序技术进行检测进一步寻找致病突变，首先以非综合征型耳聋基因panel1(包含18个非综合征型耳聋基因的82个已知突变位点)检测，再随机选取15名患者进行遗传性耳聋基因panel2(包含215个已知的遗传性耳聋基因，其中有88个非综合征型耳聋基因和127个综合征型耳聋基因)检测。
结果：1.建立了针对中国人群4个常见致聋基因20个突变热点的基因检测方法。2.对316例拟诊为非综合征型耳聋患者外周血标本进行悬浮技术检测，共检出161例有基因突变，其中纯合或复合杂合突变65例，突变阳性率为50.9%，诊断率为21.2%。3.对悬浮阵列技术检测到GJB2或SLC26A4基因为单杂合突变的患者，采用Sanger测序对该基因进行测序，18例得到补充诊断，诊断率提高到26.9%。4.未得到确诊的229名患者，采用目标序列捕获结合高通量测序技术进行18个基因82个突变位点的检测，检测到5个基因10个突变位点，可对2名患者确诊，将诊断率提高到28.2%。在229名患者中随机选取15名患者进行215个遗传性耳聋基因的检测，在14名患者中检测到12个基因18个可疑致病突变。
结论：1.成功建立了针对中国人群4个常见致聋基因20个突变热点的悬浮阵列技术检测方法，该技术具有高通量、高效能、低成本、操作简便等优点，适用于临床大范围推广，有望成为一种极具潜力的耳聋基因检测工具。2.目标序列捕获结合高通量测序技术具有覆盖率高的优点，可以弥补传统的遗传性耳聋基因检测技术的不足，是发现罕见突变及新致病突变的有力工具。3.多种检测技术相结合，既保留了热点突变筛查的高效、快速、低成本、准确等优点，又弥补了非突变热点在耳聋人群易漏诊的缺点，并可发现新的致病突变，提高了耳聋基因诊断率。为临床耳聋诊断工作提供了一套可选的技术方法，更好地进行遗传性耳聋的防治及开展优生优育工作，同时也为进行耳聋致病基因的功能研究打下了基础。
目的：基于悬浮阵列技术，建立一种可在单个反应体系中同时检测4个常见致聋基因、20个突变位点的快速分子诊断方法。利用建立的悬浮阵列技术结合目标基因捕获-高测序技术来探索非综合征型耳聋经济有效的基因诊断方案，更好地为这些患者提供遗传咨询及生育指导。
方法：1.选取1例经测序证实无基因突变的听力正常对照者、30例已知基因型患者的基因组DNA，建立耳聋悬浮阵列技术的检测平台，检测4个基因20个突变位点：GJB2基因：c.235delC，c.299-300delAT，c.109A＞G，c.176-191del16，c.35delG，c.512insAAGG；GJB3基因：c.538C＞T；SLC26A4基因：IVS7-2A＞G，c.2168C＞T，c.1229C＞T，c.1975G＞C，C.1226G＞A，c.2086C＞T，c.754T＞C，c.1174A＞T，IVS15+5G＞A，c.1693insA，c.2027T＞A；线粒体DNA12SrRNA基因：m.1555A＞G，m.1494C＞T。应用建立的悬浮阵列技术随机检测160例非综合征型耳聋患者标本，同时以临床常用的晶芯TM九项遗传性耳聋基因检测盒及Sanger测序对比实验。
2.收集2011年1月-2016年6月就诊于广东省妇幼保健院产前诊断中心及耳鼻喉专科门诊并临床拟诊为非综合征型耳聋患者标本共316例标本。我们对这些患者分三个步骤进行基因检测评估：第一步，首先采用新建立的悬浮阵列技术对患者进行4个常见基因20个突变热点的检测；第二步，对悬浮阵列技术检测到GJB2和SLC26A4基因单杂合突变的患者，采用Sanger测序对GJB2和SLC26A4基因进行测序，寻找该基因的另一致病突变。第三步，经悬浮阵列技术检测和Sanger测序均未能确诊的患者，采用目标序列捕获-高通量测序技术进行检测进一步寻找致病突变，首先以非综合征型耳聋基因panel1(包含18个非综合征型耳聋基因的82个已知突变位点)检测，再随机选取15名患者进行遗传性耳聋基因panel2(包含215个已知的遗传性耳聋基因，其中有88个非综合征型耳聋基因和127个综合征型耳聋基因)检测。
结果：1.建立了针对中国人群4个常见致聋基因20个突变热点的基因检测方法。2.对316例拟诊为非综合征型耳聋患者外周血标本进行悬浮技术检测，共检出161例有基因突变，其中纯合或复合杂合突变65例，突变阳性率为50.9%，诊断率为21.2%。3.对悬浮阵列技术检测到GJB2或SLC26A4基因为单杂合突变的患者，采用Sanger测序对该基因进行测序，18例得到补充诊断，诊断率提高到26.9%。4.未得到确诊的229名患者，采用目标序列捕获结合高通量测序技术进行18个基因82个突变位点的检测，检测到5个基因10个突变位点，可对2名患者确诊，将诊断率提高到28.2%。在229名患者中随机选取15名患者进行215个遗传性耳聋基因的检测，在14名患者中检测到12个基因18个可疑致病突变。
结论：1.成功建立了针对中国人群4个常见致聋基因20个突变热点的悬浮阵列技术检测方法，该技术具有高通量、高效能、低成本、操作简便等优点，适用于临床大范围推广，有望成为一种极具潜力的耳聋基因检测工具。2.目标序列捕获结合高通量测序技术具有覆盖率高的优点，可以弥补传统的遗传性耳聋基因检测技术的不足，是发现罕见突变及新致病突变的有力工具。3.多种检测技术相结合，既保留了热点突变筛查的高效、快速、低成本、准确等优点，又弥补了非突变热点在耳聋人群易漏诊的缺点，并可发现新的致病突变，提高了耳聋基因诊断率。为临床耳聋诊断工作提供了一套可选的技术方法，更好地进行遗传性耳聋的防治及开展优生优育工作，同时也为进行耳聋致病基因的功能研究打下了基础。