论文部分内容阅读
目的：初步探讨融合蛋白CTP-FoxM1对小鼠骨髓来源DCs的免疫活化作用,为探索其是否能够在体内发挥免疫效应奠定基础。方法：(1)无菌条件下分离小鼠骨髓来源的细胞,红细胞裂解液裂解红细胞后,GM-CSF联合IL-4体外诱导培养细胞至第7d,光镜下观察细胞的形态,流式细胞术分析检测细胞表面分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表达情况,ELISA法检测细胞培养上清中IL-12的释放水平,MLR检测细胞刺激同种异体淋巴细胞的能力。(2)融合蛋白CTP-FoxM1、CTP、FoxM1分别作用DCs 48h后,CCK-8试剂盒检测其存活率,流式细胞术检测其表面分子表达情况,ELISA法检测其培养上清中IL-12的分泌水平。(3)DCs经融合蛋白CTP-FoxM1、CTP、FoxM1作用48h后,与小鼠脾脏来源的CD8+T细胞共同培养72h, ELISA试剂盒检测上清液中IFN-γ、TNF-α的分泌情况。结果：(1)从每只小鼠的骨髓可获得约3×107个细胞,光学显微镜下可见细胞伸出“树枝状”突起,经流式细胞仪检测,细胞表面标志性分子CD11c表达量为88±4.66%,与未经LPS刺激的细胞相比,经LPS刺激的细胞表面分子表达量明显增高(P<0.001),其培养上清中的IL-12水平增高(P<0.001)。结果表明通过该方法成功获得较高纯度的DCs。MLR实验显示经DCs作用后的T细胞其增殖率明显较未经DCs作用的T细胞高(P<0.01),表明经该方法分离诱导培养的DCs具有较强的刺激T淋巴细胞增殖的能力。(2) CTP-FoxM1对DCs的存活有抑制作用,且在一定范围内与浓度呈正相关。与蛋白CTP、FoxM1相比,CTP-FoxM1可明显上调DCs表面分子CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表达量(P<0.001),促进DCs培养上清中IL-12的分泌(P<0.001)。(3)将融合蛋白CTP-FoxM1、CTP、FoxM1抗原负载的DCs与CD8+T淋巴细胞共培养,CTP-FoxM1组上清液中细胞因子IFN-γ、 TNF-α的分泌量较CTP组(P<0.001,P<0.001)和FoxM1组高(P<0.001,P<0.01)。结论：(1)经本实验室改进,红细胞裂解法能够分离出纯度较高的DCs,可以满足后续实验；(2)融合蛋白CTP-FoxM1能够上调DCs表面分子表达,诱导IL-12分泌,具有免疫活化DCs的潜能。(3) CTP-FoxM1作用后的DCs与CD8+T淋巴细胞共培养后,其上清IFN-γ、TNF-α分泌水平显著上调,提示CTP-FoxM1可能具有诱导DCs发挥抗原交叉递呈功能,介导CD8+T淋巴细胞发挥CTL免疫应答的潜能。