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目的：肝纤维化是多种慢性肝脏病变最终进展到肝硬化的一个重要中间过程，以肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化和细胞外基质（extracel lular matrix,ECM）的大量沉积为主要特征。研究证实，Wnt信号通路在肝纤维化的过程当中起到了重要的作用，其中以Wnt/β-catenin研究的最多。中药肝复康是我校病理生理教研室经多年实验总结出的抗肝纤维化的经验方，已证实对Wnt/β-catenin通路和非经典的Wnt/Ca2+信号通路均有抑制作用。目前，在对肿瘤一些的研究中发现，Wnt/Ca2+信号通路能够对Wnt/β-catenin通路起到抑制的作用，即说明了这两条通路在有些肿瘤中并不是单一的产生作用，而两条通路之间也是可能存在某种相互关系，能够相互影响，但在对肝纤维化的研究中则主要研究的是每条通路与肝纤维化的发生发展可能存在的某些机制，但对这两条通路之间的相互关系却还不十分明确。SB216763是GSK-3β的抑制剂，使胞浆中β-catenin大量累积并入核，从而激活Wnt/β-catenin通路。本实验通过使用中药肝复康药物血清和SB216763干预培养的HSC，然后分析在肝纤维化发生发展过程中Wnt/β-catenin通路与Wnt/Ca2+信号通路之间的相互关系。方法：用含10%胎牛血清的DMEM培养基在5%CO2混合气体、37℃的孵箱中培养，传代大鼠HSC-T6细胞株。待细胞条件成熟后，再用不含血清的DMEM培养基饥饿培养24h后分组加药。在六孔板中将细胞随机的分为以下五组：正常血清组（含10%正常大鼠血清的DMEM培养基）；SB21676320μM组(含10%正常大鼠血清，SB2167632umol/L的DMEM培养基）；SB21676310μM组（含10%正常大鼠血清，SB2167631umol/L的DMEM培养基）：肝复康治疗组（含10%肝复康治疗组大鼠血清的DMEM培养基）；SB21676320μM加肝复康治疗组（SB21676320μM基础上用10％肝复康药物血清干预），用孵箱在37℃，5%CO2混合气体的环境中培养48h。逆转录-聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)法检测HSC细胞中collagen I，collagen Ⅲ，a-SMA的表达和Wnt/Ca2+信号通路中的相关指标Wnt5a， Frizzled2，CAMKII， MPP-7mRNA相对表达量,免疫蛋白印迹法（western blot）检测细胞中MPP-7的蛋白表达量。实验结果均采用SPSS13.0统计软件分析。结果：1、SB216763与肝复康对大鼠HSC-T6细胞活性及a-SMA、I型、III型胶原的影响1.1RT-PCR检测SB216763对大鼠HSC-T6细胞活性及a-SMA、I型、III型胶原的影响SB21676310μM与SB21676320μM组HSC明显活化, I型胶原、 Ⅲ型胶原、a-SMA表达量与正常血清组相比显著增加，其中又以SB21676320μM组增多的更为明显，说明使用SB216763后HSC-T6细胞株有明显的纤维化倾向。1.2RT-PCR检测肝复康对HSC-T6中I型胶原、 Ⅲ型胶原、a-SMA表达的影响肝复康药物血清组与SB21676310μM、SB21676320μM组相比，HSC细胞中I型胶原、 Ⅲ型胶原、a-SMA的表达量显著减少，同时SB21676320μM加肝复康血清组与SB21676320μM组相比，三者的表达量均有所减少，说明肝复康能够有效的抑制I型胶原、 Ⅲ型胶原、a-SMA在HSC-T6细胞株中的表达。2、SB216763和肝复康对HSC-T6细胞株中Wnt/Ca2+信号通路相关指标表达的影响2.1RT-PCR检测Wnt/Ca2+信号通路中Wnt5a的mRNA表达Wnt5a是Wnt/Ca2+信号通路是一种重要的起始蛋白，在正常大鼠肝脏细胞中含量很少，几乎不表达。虽然Wnt与不同的受体结合后，能够激活不同的Wnt通路，包括经典Wnt通路，但在本实验中，Wnt经典通路激活后，通过RT-PCR显示，各组Wnt5a的mRNA相对表达量与对照组相比无明显差异，无统计学意义。2.2RT-PCR检测Wnt/Ca2+信号通路中Frizzed2的mRNA表达Frizzed2是Wnt信号通路的中一种跨膜受体蛋白， Wnt5a与其结合后激活Wnt/Ca2+信号通路，在正常大鼠肝脏细胞中表达很少，几乎不表达。通路RT-PCR测其在SB21676320μM、10μM、肝复康药物血清治疗组、肝复康加SB216763的mRNA相对表达量与正常血清对照组相比无明显变化。2.3RT-PCR检测Wnt/Ca2+信号通路中CAMKII的mRNA表达CAMKII是Wnt/Ca2+信号途径下游一种关键的蛋白激酶，在正常大鼠肝脏细胞表达微量，几乎不表达。通过RT-PCR检测CAMKII在各组的mRNA相对表达量，发现与正常血清对照组相比没有表达差异，无统计差异性，说明在使用SB216763后，Wnt/Ca2+信号途径可能没有受到Wnt/β-Catenin信号通路的影响而发生相应的改变。2.4RT-PCR检测Wnt/Ca2+信号通路MMP-7的mRNA表达MMP-7在正常大鼠肝脏细胞中表达很少，几乎不表达。在RT-PCR检测结果中，虽然与正常血清对照组相比，SB21676320μM组中的mRAN表达相对量增加，但是差异没有有显著性。在其它三组SB21676310μM、肝复康药物血清组及肝复康加SB21676320μM中的mRNA相对表达量均无明显变化。3Western-blot检测实验结果MPP-7在正常肝脏组织细胞很少表达，几乎不表达。与正常血清组相比SB21676320μM增多较为明显，10μM及肝复康、肝复康加SB216763组表达则无明显差别，且表达均不明显，与RT-PCR的实验结果一致，这可能与其复杂的表达调控有关。结论：1、Wnt/β-catenin信号通路激活后，可上调大鼠HSC-T6细胞活性；肝复康对活化的大鼠HSC-T6细胞有一定的抑制作用。2、Wnt/β-catenin信号通路激活后，Wnt/Ca2+信号通路可能不受相关影响。