【摘 要】
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目的:本研究拟探讨利用超声靶向微泡破坏（Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD）法介导人血清外泌体作为新型药物载体携多柔比星（Doxorubicin,DOX）进入人肝癌Hep G2细胞的可行性;并在此基础上观察其对细胞增殖的影响;为肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma HCC）的分子靶向药物治疗提供新的科研思路。方法
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目的:本研究拟探讨利用超声靶向微泡破坏（Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD）法介导人血清外泌体作为新型药物载体携多柔比星（Doxorubicin,DOX）进入人肝癌Hep G2细胞的可行性;并在此基础上观察其对细胞增殖的影响;为肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma HCC）的分子靶向药物治疗提供新的科研思路。方法:1.外泌体提取试剂盒法分离、纯化人血清外泌体。2.透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）观察外泌体的形态结构并用蛋白免疫印迹法（Western blotting）进行标志性蛋白鉴定。3.UTMD法促进外泌体进入人肝癌Hep G2细胞的实验研究。4.荧光显微镜检测人肝癌Hep G2细胞中外泌体的分布和含量。5.电穿孔法及非电穿孔法（直接孵育法）促外泌体装载多柔比星的实验研究。6.外泌体提取试剂盒法重提取各实验分组中经多柔比星预处理后的人血清外泌体。7.流式细胞术检测人肝癌Hep G2细胞中多柔比星的分布及含量。8.细胞增殖-毒性检测盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测UTMD法介导携多柔比星外泌体进入人肝癌Hep G2细胞后细胞的增殖情况。结果:1.外泌体提取试剂盒所提取的物质在电镜下观察表现为脂质双分子层结构,粒径大约在30-150 nm范围内,且表达外泌体表面标记蛋白跨膜蛋白63（CD63）、肿瘤易感基因101（TSG101）及热休克蛋白70（HSP70）。2.荧光染料标记好的外泌体作用细胞后,荧光显微镜检测各组肿瘤细胞中的荧光强度,其中空白组的平均荧光强度为（0.000±0.000）、外泌体组为（0.084±0.006）、微泡+外泌体组为（0.104±0.011）、超声辐照+外泌体组为（0.081±0.004）、微泡+超声辐照+外泌体组为（0.114±0.002）、外泌体+微泡+超声辐照组为（0.177±0.005）,结果显示外泌体+微泡+超声辐照组的平均荧光强度显著高于其他各组,差异均有统计学意义（P<0.05）。3.通过流式细胞术检测空白组的平均荧光强度为（5.93±1.74）,磷酸缓冲盐溶液加多柔比星（PBS+DOX）重提组细胞中平均荧光强度为（147.33±4.50）,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.通过流式细胞术检测各组细胞中的荧光强度,空白组平均荧光强度（5.93±1.74）,PBS+DOX重提组平均荧光强度为（147.33±4.50）,血清外泌体加多柔比星（EXO+DOX）电穿孔组的平均荧光强度为（464.00±6.24）,EXO+DOX非电穿孔组（直接孵育组）的平均荧光强度为（467.00±24.63）;EXO+DOX电穿孔组及非电穿孔组（直接孵育组）平均荧光强度明显高于空白组及PBS+DOX重提组,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.通过流式细胞术检测各组细胞的平均荧光强度,EXO+DOX电穿孔组与EXO+DOX非电穿孔组（直接孵育组）中的平均荧光强度大致相同,差异无统计学意义（P>0.05）。6.CCK8法检测人肝癌Hep G2细胞的增殖情况,其中空白组、EXO+DOX组、（EXO+DOX）+微泡+辐照组的OD分别为（0.83±0.016）、（0.62±0.009）、（0.31±0.006）,其中（EXO+DOX）+微泡+辐照组细胞存活率最低,各组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.UTMD法可促进人血清外泌体进入人肝癌Hep G2细胞。2.人血清外泌体可携带多柔比星进入人肝癌Hep G2细胞。3.电穿孔法与非电穿孔法（直接孵育法）均可促进外泌体携带多柔比星,在本实验中两者药物负载率无明显差异。4.UTMD法可明显促进多柔比星-外泌体进入人肝癌Hep G2细胞并抑制其增殖。
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