酵母表面展示果糖基转移酶合成低聚果糖

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作为一种功能性低聚糖,低聚果糖由于其独特的生理功能及其在食品工业中有着较大的经济潜力,而受到高度的关注。低聚果糖可以高效促进人体肠道中的双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖,同时可以有效地预防心血管疾病、直肠癌和骨质疏松的发生。目前,工业上主要以纯酶或者细胞转化方法生产低聚果糖。本课题通过分子克隆技术,从一株高产果糖基转移酶的米曲霉CGMCC3.800菌株中获得果糖基转移酶基因。以能够产生赤藓糖醇的解脂耶氏酵母CGMCC7326为出发菌株,利用细胞壁蛋白Pir1p为锚定蛋白,实现了果糖基转移酶在解脂耶氏酵母细胞表面的展示,获得了能够转化蔗糖生成低聚果糖的工程菌株解脂耶氏酵母CGMCC11368。测得工程菌株所具有的最高果糖基转移活性和水解活性分别为0.85±0.04 U/mg(干重细胞)、0.11±0.02 U/mg(干重细胞),即AT/AH的值为7.7。通过免疫荧光标记技术,确认来自米曲霉的果糖基转移酶成功的展示在工程菌株细胞的表面。除此之外,我们还探究了展示在解脂耶氏酵母细胞表面的果糖基转移酶的酶活性质:其最适反应温度为60℃,比游离的果糖基转移酶最适温度高出5-10℃,这可以有效的加快反应速率,提高生产效率;最适反应pH值为6.0;赤藓糖醇发酵后的酵母细胞泥可以被重复利用至少10次。同时,相比米曲霉CGMCC3.800,工程菌株解脂耶氏酵母CGMCC11368具有更高的转化活性和转化速率。我们利用工程菌株解脂耶氏酵母CGMCC11368发酵葡萄糖,生产高利用价值的赤藓糖醇。发酵结束后离心收集酵母细胞,作为全细胞催化转化高浓度蔗糖生成低聚果糖。在蔗糖浓度为800 g/L,酵母细胞为5.0 mg/mL(干重细胞)的转化体系,温度为60℃、pH为6.0的转化条件下,转化3 h得到低聚果糖的产量为480 g/L,蔗糖转化率达到了60%,其生产率达到已报道的最高值160 g L-1 h-1。转化过程中所产生的大量葡萄糖可在后续实验中通过解脂耶氏酵母CGMCC7326发酵生成赤藓糖醇。此方法在大规模生产低聚果糖上生产成本更低,具有更大的应用价值。
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