研究背景癫痫是一个的危害人类健康的常见疾病,近年来癫痫的发病率有逐年升高趋势。目前口服抗癫痫药物(antiepileptic drugs, AEDs)仍是治疗癫痫的首选和主要方法。在过去的20年中,尽管不断有新的抗癫痫药投入临床应用,但仍有30%左右的癫痫患者对抗癫痫药不敏感,出现难以被控制的反复癫痫发作,临床上称之为难治性癫痫。难治性癫痫的预后不佳,有较高的致残和致死率,因此研究难治性癫痫对AEDs产生耐药的原因,发现新的治疗措施,具有重要意义。难治性癫痫的一个重要特征是患者对一种AEDs耐药的同时,对其它不同作用机制AEDs也产生耐药性,这种现象被称为多药耐药(multidrug resistance,MDR)。在多药耐药研究领域,研究最多的是MDR1基因编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp),它利用分解ATP所释放的能量主动将药物泵出细胞外,导致细胞内药物浓度降低。研究发现,血脑屏障血管内皮细胞及星形胶质细胞,皮层和海马的神经元、星形胶质细胞、血管内皮细胞上均有P-gp的表达。研究证实,大多数抗癫痫药物如苯妥英钠、丙戊酸纳等都是P-gp的天然底物,P-糖蛋白通过耗能方式主动将抗癫痫药物泵出细胞外,导致癫痫病灶内药物浓度的降低,使抗癫痫药物不能有效发挥作用,这可能是引起难治性癫痫多药耐药的重要机制之一。多项研究发现有效抑制多药转运体,可以逆转多药耐药。在P-糖蛋白拮抗剂中研究最多的是钙通道阻滞剂,本类药物逆转多药耐药的作用可能是因为它抑制了P-gp的表达或活性从而逆转多药耐药。但已知的拮抗剂尚具有其它药理活性甚至非特异性的细胞毒性作用而使它开展临床研究受到限制。因此,发现一种选择性高、毒性小的拮抗剂将为治疗癫痫耐药提供有力帮助。粉防己碱(tetrandrine, TTD, Tet)是中药汉防己科植物粉防己中提取的双苄基异喹啉生物碱。研究提示,粉防己碱是一种天然非选择性的电压依赖型的钙通道阻滞剂。国内早在80年代已将粉防己碱广泛用于临床治疗高血压、心绞痛等疾病,已取得了较好疗效。多项研究证明,粉防己碱有逆转多药耐药的作用,但其逆转机制尚不十分清楚,粉防己碱是否能逆转抗癫痫药物的多药耐药,目前的研究报道不多。本课题将从2个方面进行研究：1、观察粉防己碱干预后耐药细胞对于苯妥英钠、丙戊酸纳耐药性的变化。2、观察粉防己碱干预后对难治性癫痫大鼠Racine行为分级的变化及脑内MDR1mRNA和P-gp的表达的变化。从体内与体外两个不同的角度研究粉防己碱对于难治性癫痫多药耐药的逆转作用。本研究共分体内和体外两部分：第一部分：1.CCK-8法检测耐药细胞K562/ADM及敏感细胞K562对抗癫痫药物(苯妥英钠、丙戊酸纳)的耐药性。2.CCK-8法检测粉防己碱干预后耐药细胞K562/ADM及敏感细胞K562对抗癫痫药物(苯妥英钠、丙戊酸纳)耐药性的变化。第二部分：1.戊四氮(40mg/kg)腹腔注射化学点燃慢性癫痫大鼠,使用大剂量多种AEDs(苯妥英钠、丙戊酸纳、卡马西平)灌胃2周,诱导难治性癫痫大鼠,根据癫痫行为和脑电图筛查难治性癫痫大鼠。2.观察粉防己碱干预后难治性癫痫大鼠Racine行为分级的变化。3.分别采用Real-timePCR、Western-blot的方法观察粉防己碱干预后难治性癫痫大鼠皮层、海马MDRlmRNA和P-gp的表达变化。实验结果如下：第一部分实验结果：1.与敏感细胞组相比,耐药细胞K562/ADM对于抗癫痫药物苯妥英钠和丙戊酸纳均具有显著耐药性(P<0.05)2.与未加粉防己碱耐药细胞组相比,粉防己碱组耐药细胞K562/ADM对苯妥英钠和丙戊酸纳的耐药性明显下降(P<0.05)。第二部分实验结果：1.共点燃成功慢性癫痫大鼠44只,3只死亡,3只未诱导成功,成功率88%。共筛选出难治性癫痫大鼠32只,灌胃死亡3只,无效9只,成功率74.4%,总成功率64%。2.与对照组相比,粉防己碱组大鼠在给予粉防己碱后,其Ⅳ-Ⅴ级癫痫大发作多转为Ⅱ-Ⅲ级癫痫小发作,其Racine行为分级明显下降(P<0.05)3.与正常组相比,难治性癫痫模型大鼠脑内皮层、海马MDRlmRNA和P-gp表达显著增高(P<0.01)。4.与耐药组相比,粉防己碱处理组难治性癫痫大鼠脑内皮层、海马MDRlmRNA和P-gp表达降低(P<0.05)。5.与粉防己碱低剂量组(lOmg/kg)相比,粉防己碱高剂量组(30mg/kg)难治性癫痫大鼠脑内皮层、海马MDRlmRNA和P-gp表达降低更为明显,但无统计学差异(P>0.05)。结论：1.粉防己碱可以明显逆转P-gp高表达的耐药细胞对于抗癫痫药物的耐药性2.粉防己碱可降低难治性癫痫模型大鼠Racine行为分级。3粉防己碱可降低难治性癫痫模型大鼠脑内皮层、海马P-gpmRNA和P-gp的表达。