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背景：
肝糖原累积病Ⅰb型（Glycogen storage disease typeⅠb，GSDⅠb，OMIM：232220）是糖原累积病常见类型之一，占肝糖原累积病Ⅰ型（Glycogen storage disease typeⅠ，GSDⅠ）的20%，是一种由SLC37A4（OMIM：602671)基因突变导致葡萄糖-6-磷酸转移酶(glucose-6-phosphate translocase，G6PT)缺乏的常染色体隐性遗传病。SLC37A4基因位于11号染色体11q23.3,全长约4.5kb，含9个外显子，编码含429个氨基酸的G6PT蛋白，目前已有107种突变被报道（http://www.hgmd.org）。SLC37A4基因突变既有明显的地域性，又有高度的分散性，各个地区的突变热点不同。由它编码的G6PT蛋白是位于细胞内质网上的跨膜蛋白，G6PT酶负责转运葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phophate,G6P），协助葡萄糖-6-磷酸酶系统（G6Pase）催化G6P转化为葡萄糖和磷酸（Pi），维持血糖稳定。
自科学家成功克隆SLC37A4基因以来，国内外学者对GSDⅠb的研究逐渐从疾病的诊断、治疗扩展至对疾病发生、发展以及致病机制的研究，但目前对于GSDⅠb的致病机制及治疗的研究仍存在许多困境。不同于肝糖原累积病Ⅰa型（Glycogen storage disease typeⅠa，GSDⅠa，OMIM：232220）的患儿，通常只有空腹低血糖、肝脏增大、高脂血症、高乳酸血症及高尿酸血症等糖原代谢紊乱症状，给予饮食控制，定期监测，口服生粟米粉（uncooked comstarch,UCCS）后预后良好。GSDⅠb型的患儿除了具有糖原代谢紊乱的临床表现外，还由于中性粒细胞减少及白细胞功能障碍，患儿易反复感染，出现口腔和肠道黏膜溃疡、炎症性肠病等，从而导致预后不良。目前GSDⅠb型患儿中性粒细胞减少及白细胞功能障碍的致病机制尚未明确，为此针对此类患儿进行精准治疗，靶向治疗及预测预后仍难以实现。
随着分子生物学研究的快速发展，临床和基因诊断GSDⅠb已应用的越来越广泛，越来越多的基因突变被发现，如何鉴定这些基因突变的功能，是否具有致病性已成为当前的关键。只有确定了突变基因的致病性，才能帮助已有先证者的家庭进行遗传咨询与产前诊断。
自2011年开始，本课题中心从临床诊断和基因分析等方面对GSDⅠ型患者进行了系列研究。根据临床表现、生化检查及胰高血糖素刺激试验结果，临床诊断出109例肝糖原累积病(LGSDs)患儿。提取外周血基因组DNA，采用PCR直接测序法对SLC37A4基因9个外显子及两侧侧翼序列进行突变分析，检出突变后对先证者父母亲DNA进行相关位点分析，发现GSDⅠb患儿15例。其中发现2个新突变：c.959-960insT及c.454G＞C(p.G152R)。新突变采用50名无血缘关系健康儿童的100个等位基因作为正常对照，排除基因多态性。另外，目前国内报道的c.68T＞G（p.L23R）、c.343G＞A（p.G115R）、c.842G＞T（p.G281V）致病性均不能确定。
本研究对该5种c.959-960insT、c.454G＞C(p.G152R)、c.68T＞G（p.L23R）、c.343G＞A（p.G115R）、c.842G＞T（p.G281V）突变，分别构建突变体和野生型SLC37A4与EGFP融合基因表达质粒为基础，并体外转染COS-1细胞，直接观察融合蛋白绿色荧光，通过Western blot检测验证蛋白表达。
目的：
本研究采用生物信息学及SLC37A4基因体外瞬时表达体系，对SLC37A4基因新突变进行致病性鉴定及体外功能学鉴定，探讨其致病的可能机理。
方法：
1.5种新突变c.959-960insT、c.454G＞C(p.G152R)、c.68T＞G（p.L23R）、c.343G＞A（p.G115R）、c.842G＞T（p.G281V）均采用50名无血缘关系健康儿童的100个等位基因作为正常对照，排除基因多态性。本研究对新突变进行了12个不同物种突变点氨基酸保守性分析；
2.使用SIFT、Polyphen-2软件在线分析进行5种新突变致病性预测；
3.使用SWISS-MODEL在线软件预测目的蛋白的三维结构；
4.本研究以表达增强型绿色荧光蛋白质的质粒pEZ-EGFP为空载体，构建pEZ-SLC37A4-EGFP野生型载体，体外定点诱变成新突变位点相应的突变型载体，并同时构建了一个已知致病突变c.446G＞A(p.G149E)载体及多态位点c.405C＞T(p.G135=)载体，转染COS-1细胞，建立SLC37A4基因体外真核表达体系，并进行Western印迹分析蛋白的表达，对5个新突变的致病性进行鉴定。
结果：
1.新突变在G6PT蛋白氨基酸一级结构中的位置：本研究中的5种新突变，100个等位基因未发现相同突变，其在G6PT蛋白氨基酸一级结构中具体分布如下：L23R位于1号外显子，G115R位于2号外显子，G152R位于3号外显子，G281V位于6号外显子，以及959-960insT插入突变位于8号外显子。5种新突变的12个不同物种突变点氨基酸保守性分析提示均高度保守或半保守；
2.在线软件致病性预测结果：对其中4种新的错义突变分别进行了SIFT及Polyphen-2软件预测分析，结果显示4种突变的SIFT评分均接近0，Polyphen-2评分均接近1；
3.突变蛋白三维结构预测结果：对人类G6PT蛋白进行生物信息学分析，通过在线软件SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）预测其蛋白三维结构。同源模建得出的人类G6PT分子结构是由12个螺旋组成的跨膜蛋白。本研究发现的5种突变包括4个点突变和1个缺失突变：点突变分别位于α1螺旋（p.L23R）、α4螺旋（p.G115R）、α5螺旋（p.G152R）和α8螺旋（p.G281V）；缺失突变使C末端自第325位氨基酸残基之后的的326-429号残基全部缺失，蛋白丢失了α10、α11、α12三个螺旋；
4.突变载体真核表达及Western blot检测结果：构建pEZ-SLC37A4-EGFP真核表达质粒经测序分析鉴定，体外定点诱变构建（p.L23R，p.G115R，p.G135=，p.G149E，p.G152R，p.G281V，c.959-960insT）7种突变型质粒。空载体、野生型及突变型(除外c.959-960insT插入突变，本研究中的pEZ-SLC37A4-EGFP质粒，SLC37A4-EGFP为融合基因，c.959-960insT基因突变造成SLC37A4基因终止密码子提前出现，使其后的EGFP蛋白不能表达，从而无绿色荧光出现）)载体转染COS-1细胞72h后，荧光显微镜下观察各组细胞均见明亮绿色荧光。Western blot检测SLC37A4野生型和突变型与EGFP融合蛋白在COS-1细胞中的表达，结果提示，空载体、野生型及7种突变型载体转染的COS-1细胞内参GAPDH表达一致，野生型及多态型载体转染的COS-1细胞见目的条带，已知致病突变、5种新突变及空载体均未见目的条带，未检测出G6PT蛋白表达。
结论：
1.通过SLC37A4基因突变分析，我们确诊了15例GSDⅠb型患儿，发现两个新突变：c.959-960insT及c.454G＞C(p.G152R)，丰富了国内SLC37A4基因突变谱；排除了5种新突变的多态性，氨基酸保守性分析提示均为高度保守或半保守，提示当上述位点突变时，可能影响G6PT酶蛋白的正常结构和生物学功能，从而导致下游产物的生成障碍而致病，出现相应的临床症状；
2.在线软件SIFT及Polyphen-2的新突变致病性预测结果提示新突变致病可能性大；
3.SWISS-MODEL软件在线模拟了突变蛋白三维结构，从结构上看，5个突变位点均位于蛋白的重要跨膜区域，有可能对结构的稳定性产生显著影响，进一步论证了突变的致病可能性，为SLC37A4基因新突变生物信息学分析积累了经验；
4.首次在国内采用瞬时转染的方法进行了SLC37A4基因突变的功能研究。本研究构建了7种SLC37A4基因突变载体，经COS-1细胞瞬时表达研究发现野生型及多态型蛋白可以得到表达，突变型蛋白不能正常表达。
肝糖原累积病Ⅰb型（Glycogen storage disease typeⅠb，GSDⅠb，OMIM：232220）是糖原累积病常见类型之一，占肝糖原累积病Ⅰ型（Glycogen storage disease typeⅠ，GSDⅠ）的20%，是一种由SLC37A4（OMIM：602671)基因突变导致葡萄糖-6-磷酸转移酶(glucose-6-phosphate translocase，G6PT)缺乏的常染色体隐性遗传病。SLC37A4基因位于11号染色体11q23.3,全长约4.5kb，含9个外显子，编码含429个氨基酸的G6PT蛋白，目前已有107种突变被报道（http://www.hgmd.org）。SLC37A4基因突变既有明显的地域性，又有高度的分散性，各个地区的突变热点不同。由它编码的G6PT蛋白是位于细胞内质网上的跨膜蛋白，G6PT酶负责转运葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phophate,G6P），协助葡萄糖-6-磷酸酶系统（G6Pase）催化G6P转化为葡萄糖和磷酸（Pi），维持血糖稳定。
自科学家成功克隆SLC37A4基因以来，国内外学者对GSDⅠb的研究逐渐从疾病的诊断、治疗扩展至对疾病发生、发展以及致病机制的研究，但目前对于GSDⅠb的致病机制及治疗的研究仍存在许多困境。不同于肝糖原累积病Ⅰa型（Glycogen storage disease typeⅠa，GSDⅠa，OMIM：232220）的患儿，通常只有空腹低血糖、肝脏增大、高脂血症、高乳酸血症及高尿酸血症等糖原代谢紊乱症状，给予饮食控制，定期监测，口服生粟米粉（uncooked comstarch,UCCS）后预后良好。GSDⅠb型的患儿除了具有糖原代谢紊乱的临床表现外，还由于中性粒细胞减少及白细胞功能障碍，患儿易反复感染，出现口腔和肠道黏膜溃疡、炎症性肠病等，从而导致预后不良。目前GSDⅠb型患儿中性粒细胞减少及白细胞功能障碍的致病机制尚未明确，为此针对此类患儿进行精准治疗，靶向治疗及预测预后仍难以实现。
随着分子生物学研究的快速发展，临床和基因诊断GSDⅠb已应用的越来越广泛，越来越多的基因突变被发现，如何鉴定这些基因突变的功能，是否具有致病性已成为当前的关键。只有确定了突变基因的致病性，才能帮助已有先证者的家庭进行遗传咨询与产前诊断。
自2011年开始，本课题中心从临床诊断和基因分析等方面对GSDⅠ型患者进行了系列研究。根据临床表现、生化检查及胰高血糖素刺激试验结果，临床诊断出109例肝糖原累积病(LGSDs)患儿。提取外周血基因组DNA，采用PCR直接测序法对SLC37A4基因9个外显子及两侧侧翼序列进行突变分析，检出突变后对先证者父母亲DNA进行相关位点分析，发现GSDⅠb患儿15例。其中发现2个新突变：c.959-960insT及c.454G＞C(p.G152R)。新突变采用50名无血缘关系健康儿童的100个等位基因作为正常对照，排除基因多态性。另外，目前国内报道的c.68T＞G（p.L23R）、c.343G＞A（p.G115R）、c.842G＞T（p.G281V）致病性均不能确定。
本研究对该5种c.959-960insT、c.454G＞C(p.G152R)、c.68T＞G（p.L23R）、c.343G＞A（p.G115R）、c.842G＞T（p.G281V）突变，分别构建突变体和野生型SLC37A4与EGFP融合基因表达质粒为基础，并体外转染COS-1细胞，直接观察融合蛋白绿色荧光，通过Western blot检测验证蛋白表达。
目的：
本研究采用生物信息学及SLC37A4基因体外瞬时表达体系，对SLC37A4基因新突变进行致病性鉴定及体外功能学鉴定，探讨其致病的可能机理。
方法：
1.5种新突变c.959-960insT、c.454G＞C(p.G152R)、c.68T＞G（p.L23R）、c.343G＞A（p.G115R）、c.842G＞T（p.G281V）均采用50名无血缘关系健康儿童的100个等位基因作为正常对照，排除基因多态性。本研究对新突变进行了12个不同物种突变点氨基酸保守性分析；
2.使用SIFT、Polyphen-2软件在线分析进行5种新突变致病性预测；
3.使用SWISS-MODEL在线软件预测目的蛋白的三维结构；
4.本研究以表达增强型绿色荧光蛋白质的质粒pEZ-EGFP为空载体，构建pEZ-SLC37A4-EGFP野生型载体，体外定点诱变成新突变位点相应的突变型载体，并同时构建了一个已知致病突变c.446G＞A(p.G149E)载体及多态位点c.405C＞T(p.G135=)载体，转染COS-1细胞，建立SLC37A4基因体外真核表达体系，并进行Western印迹分析蛋白的表达，对5个新突变的致病性进行鉴定。
结果：
1.新突变在G6PT蛋白氨基酸一级结构中的位置：本研究中的5种新突变，100个等位基因未发现相同突变，其在G6PT蛋白氨基酸一级结构中具体分布如下：L23R位于1号外显子，G115R位于2号外显子，G152R位于3号外显子，G281V位于6号外显子，以及959-960insT插入突变位于8号外显子。5种新突变的12个不同物种突变点氨基酸保守性分析提示均高度保守或半保守；
2.在线软件致病性预测结果：对其中4种新的错义突变分别进行了SIFT及Polyphen-2软件预测分析，结果显示4种突变的SIFT评分均接近0，Polyphen-2评分均接近1；
3.突变蛋白三维结构预测结果：对人类G6PT蛋白进行生物信息学分析，通过在线软件SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）预测其蛋白三维结构。同源模建得出的人类G6PT分子结构是由12个螺旋组成的跨膜蛋白。本研究发现的5种突变包括4个点突变和1个缺失突变：点突变分别位于α1螺旋（p.L23R）、α4螺旋（p.G115R）、α5螺旋（p.G152R）和α8螺旋（p.G281V）；缺失突变使C末端自第325位氨基酸残基之后的的326-429号残基全部缺失，蛋白丢失了α10、α11、α12三个螺旋；
4.突变载体真核表达及Western blot检测结果：构建pEZ-SLC37A4-EGFP真核表达质粒经测序分析鉴定，体外定点诱变构建（p.L23R，p.G115R，p.G135=，p.G149E，p.G152R，p.G281V，c.959-960insT）7种突变型质粒。空载体、野生型及突变型(除外c.959-960insT插入突变，本研究中的pEZ-SLC37A4-EGFP质粒，SLC37A4-EGFP为融合基因，c.959-960insT基因突变造成SLC37A4基因终止密码子提前出现，使其后的EGFP蛋白不能表达，从而无绿色荧光出现）)载体转染COS-1细胞72h后，荧光显微镜下观察各组细胞均见明亮绿色荧光。Western blot检测SLC37A4野生型和突变型与EGFP融合蛋白在COS-1细胞中的表达，结果提示，空载体、野生型及7种突变型载体转染的COS-1细胞内参GAPDH表达一致，野生型及多态型载体转染的COS-1细胞见目的条带，已知致病突变、5种新突变及空载体均未见目的条带，未检测出G6PT蛋白表达。
结论：
1.通过SLC37A4基因突变分析，我们确诊了15例GSDⅠb型患儿，发现两个新突变：c.959-960insT及c.454G＞C(p.G152R)，丰富了国内SLC37A4基因突变谱；排除了5种新突变的多态性，氨基酸保守性分析提示均为高度保守或半保守，提示当上述位点突变时，可能影响G6PT酶蛋白的正常结构和生物学功能，从而导致下游产物的生成障碍而致病，出现相应的临床症状；
2.在线软件SIFT及Polyphen-2的新突变致病性预测结果提示新突变致病可能性大；
3.SWISS-MODEL软件在线模拟了突变蛋白三维结构，从结构上看，5个突变位点均位于蛋白的重要跨膜区域，有可能对结构的稳定性产生显著影响，进一步论证了突变的致病可能性，为SLC37A4基因新突变生物信息学分析积累了经验；
4.首次在国内采用瞬时转染的方法进行了SLC37A4基因突变的功能研究。本研究构建了7种SLC37A4基因突变载体，经COS-1细胞瞬时表达研究发现野生型及多态型蛋白可以得到表达，突变型蛋白不能正常表达。