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传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)是一种导致以腹泻和高发病率为临床特征的冠状病毒,TGEV可引起小于2周龄的仔猪严重腹泻和脱水,其死亡率高达100%。所有年龄段的猪都易受TGEV感染,5周龄以上的猪往往能存活下来,但易造成预后不良,而且病毒在感染后的长达104天后仍能在肺或肠中检测到,造成TGEV持续性感染。持续性病毒感染能引起细胞发生EMT现象,导致继发感染其他病原体,例如猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)、大肠杆菌和链球菌等,但尚未有TGEV继发感染粪肠球菌(E.faecalis)的报道。肠球菌是广泛存在于乳制品、发酵食品、自然环境(即植物、土壤和水体)以及人类、其他哺乳动物、爬行动物和昆虫的胃肠道中的生物,其中粪肠球菌作为机会性病原体引发较多的感染是尿路感染和菌血症。由于所有肠道病毒都会遇到肠腔内常驻密集微生物群,因此共生细菌和肠道病毒之间可能存在大量相互作用,从而可能对该部位的病毒感染产生有益或抑制作用;相反,病毒感染也可能对细菌的感染性有影响。TGEV持续感染造成肠道损伤引发腹泻,而作为机会致病菌的粪肠球菌是引发炎症性肠病的主要菌群,因此本研究旨在应用体外试验,探索同在胃肠道中存在的TGEV和粪肠球菌之间的相互作用及其机制,主要研究内容与结果如下。首先,为了在试验中对TGEV的含量进行有效监测,建立TGEV荧光实时定量PCR检测方法,该方法根据TGEV N基因设计一条长约171bp的特异引物,通过构建标准质粒,质粒浓度为8.2×1010 copies/μL。然后对实时定量PCR反应程序进行优化,包括引物浓度、引物体积和退火温度的优化,绘制标准曲线,然后利用不同浓度的标准质粒对TGEV实时定量PCR检测方法的特异性、重复性及敏感性进行评估,结果表明TGEV与PCV2、PEDV、PRRSV无交叉反应,说明该方法具有很好的特异性;此方法能检测到的最低质粒浓度为8.2×10copies/μL,高于普通PCR10倍,说明具有良好的灵敏性。该荧光定量PCR检测方法的建立对临床样品的TGEV快速检测具有很大意义。上皮细胞向运动性间充质细胞转分化这一过程被称为上皮-间充质转换(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT),为了研究TGEV持续性感染是否可以引发IPEC-J2肠上皮细胞发生EMT,本研究以TGEV细胞感染复数比(Multiplicity of Infection,MOI)=0.1、1和10持续感染IPEC-J2细胞,并以TGF-β为阳性对照,发现TGEV在MOI=10持续感染的第五代细胞中,部分细胞由鹅卵石形态转变为细长型细胞,细胞的一些关键特性发生改变。同时通过RT-PCR和Western Blot方法在转录和蛋白表达两种水平上分析TGEV感染细胞后EMT标志物的变化,分析发现TGEV显著下调了上皮标志物E-cadherin,显著上调间充质标志物 N-cadherin、Vimentin、Smad2、Snaill、Twist 及β-Catenin 的表达。为了进一步验证持续性TGEV对细胞结构的影响,本研究采用鬼笔环肽染色检查F-actin表达情况,结果表明TGEV诱导F-actin表达增加,且使F-actin聚合成束状。为了更直观地看到发生EMT后上皮细胞运动性侵袭迁移情况,本研究又进行了划痕实验和Transwell迁移侵袭实验,结果发现很多感染TGEV的细胞在发生EMT后,细胞运动侵袭性显著增强(P<0.05),能通过8μm的孔屏障迁移至下室,而正常细胞很少能通过8μm的孔屏障,分别从平面和立体层次证明了 TGEV感染诱导细胞运动性和侵袭性增加。促炎因子对EMT的发生具有促进作用,本研究通过荧光定量PCR探究TGEV持续感染对促炎因子的影响,结果炎性因子IL-12、IL-1β、TGF-β、IL-6的转录水平趋势相似,均被TGEV显著上调,TGEV感染诱导IL-6转录水平提高了 1.6倍、IL-12提高了 2倍、IL-1β提高4倍以及TGF-β提高了 1.3倍。综合以上实验结果,证明TGEV持续感染能引起IPEC-J2细胞发生EMT。临床上TGEV感染可促进多种病原菌的继发感染,为了研究TGEV能否促进粪肠球菌的感染,本研究首先进行了粪肠球菌对持续性感染TGEV的上皮细胞的黏附侵入试验,在黏附试验中,粪肠球菌以MOI为10、50、100感染细胞,在感染6h时,TGEV对粪肠球菌的黏附有明显的促进作用,与未发生EMT细胞相比黏附数量增加了约2～3倍,在侵入试验中入侵数量较未发生EMT细胞增加了约1～2倍。为了更形象观察粪肠球菌对IPEC-J2细胞的黏附,本研究通过间接免疫荧光和场扫描电镜对粪肠球菌黏附IPEC-J2细胞的表观状态进行观察,结果发现TGEV促进粪肠球菌对IPEC-J2细胞的黏附,趋势与黏附试验结果一致,且粪肠球菌在细胞表面并非均匀分布,而是呈聚集状态分布。为了研究粪肠球菌感染发生EMT细胞后细胞因子的变化,本研究通过荧光定量PCR测定了猪肠上皮细胞系的细胞因子的变化,发现IFN-y、IL-6、IL-1β和TGF-β存在较为相似的炎症反应规律,共感染组炎性因子的转录水平低于TGEV组。IFN-γ和IL-β具有抗病毒作用,粪肠球菌感染下调其转录水平,从而促进TGEV感染;IL-6在持续炎症期间能抑制细胞凋亡,共感染组转录水平较低这一现象与粪肠球菌感染后损伤细胞有关;对于趋化因子CCL5而言,具有招募淋巴细胞的能力,所以粪肠球菌和TGEV感染均能上调其转录水平,但二者共感染使其转录水平降低,可能是由于免疫力下降促进二者感染;另外TNF-α主要由粪肠球菌诱导产生,能显著上调TNF-α的转录水平继而损伤细胞,促进病毒感染。这一现象证明TGEV与粪肠球菌的确存在相互作用,TGEV促进粪肠球菌的黏附入侵,而粪肠球菌感染引发的炎症反应又有利于病毒的感染。病毒促进病原菌感染有多种机制,为了初步探索在IPEC-J2细胞发生EMT后,粪肠球菌侵袭性增强的机制,本研究首先经场发射扫描电镜观察粪肠球菌的入胞方式,由图片分析得出粪肠球菌通过Zipper机制进行内化。然后经Western Blot分析粪肠球菌受体表达的变化,发现TGEV感染诱导粪肠球菌受体纤连蛋白(FN)和整联蛋白-α5表达增加,进一步证实粪肠球菌通过Zipper机制进行入侵。另外通过间接免疫荧光和细菌迁移实验评估TGEV细胞间隙的变化对粪肠球菌入侵的影响,间接免疫荧光结果发现TGEV诱导E-cadherin荧光信号减弱,N-cadherin信号增强,表明细胞之间连接被破坏,细胞通透性增强。同时细菌迁移实验结果表明TGEV感染显著促进粪肠球菌透过单层细胞穿越3μm孔径进入下室(P<0.05),说明细胞间隙变大,促进细菌入侵宿主内部。通过RT-PCR和Western Blot方法在转录和蛋白水平上分析粪肠球菌对EMT标志物的影响,结果发现粪肠球菌不仅对已发生的EMT具有促进作用,而且以MOI=100的浓度单独感染IPEC-J2细胞6h时也能诱导细胞发生EMT。综上所述,TGEV持续感染IPEC-J2细胞诱导其发生EMT,致使细胞由上皮细胞转换为运动性侵袭性增强的间充质细胞;另外细胞在发生EMT后,促使粪肠球菌黏附和入侵数量显著增加;粪肠球菌可通过Zipper机制与细菌受体纤连蛋白结合,进而与膜蛋白整联蛋白-α5结合入侵细胞,也可通过变大的细胞间隙入侵宿主;另外粪肠球菌不仅对TGEV引起的EMT具有促进作用,而且其单独感染亦能诱导IPEC-J2细胞发生EMT,因此形成恶性循环造成机体损伤。