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目的
核酸检测技术已广泛应用于生物医学研究,核酸(DNA和RNA)作为一种新型的检测靶标,在多种疾病的诊断和治疗中具有广泛的适用性.核酸检测技术主要通过杂交、折叠和酶催化扩增等多种技术延伸扩展而来,对生物样本中含量甚微的核酸成分检测至关重要.常见的扩增技术主要包括聚合酶链式反应(PCR),环介导温扩增技术(LAMP),链置换扩增(SDA)和滚动环扩增技术(RCA)等.随着生物医学的快速发展,PCR技术已经非常成熟,成为目前最常见的核酸扩增技术;但是PCR过程的实现具有严格的仪器、人员和环境要求,这些因素限制了PCR的临床诊断应用领域.SDA和RCA属于新型等温扩增技术,在恒温条件下对目的核酸进行扩增,相比PCR操作简单,扩增效率高且费用低廉.本研究旨在结合SDA和RCA技术设计一种新型超灵敏检测技术THP-RCA,以环状DNA为模板,从引物的3端开始扩增产生一个含有大量串联重复序列的单链DNA产物,最后通过荧光信号的读取和输出对靶标STAT3基因及其640位密码子单碱基突变进行检测,以期通过快速检测肿瘤相关基因为肿瘤的早期诊断提供新的诊断依据.
方法
1.THP-RCA检测系统的设计原理
在野生型STAT3基因存在下,靶标触发双发夹(HP1和HP2)发生环化,T4DNA连接酶催化端对端环化的HP2形成磷酸二酯键,得到环状模板.以此为复制模板,在Phi29DNA聚合酶的作用下进行扩增和信号放大,最终通过标记的荧光信号进行信号的输出.反应结束后,在492nm激发光照射下,荧光分光光度计扫描得到500nm-600nm的发射波普,以519nm处的荧光峰值来评价该检测系统对靶标的检测能力,以达到对靶标的超灵敏检测.
2.THP-RCA检测系统的评价
设计多种不同的发夹,分别组合后进行靶标检测,根据荧光强度的测定和相应信噪比的高低筛选出最佳的双发夹序列.针对反应的三个不同阶段,分别设置不同的反应时间.预杂交反应阶段设置0h,0.5h,1h,1.5h,2h五个时间段,选择信噪比最高时对应的时间点作为最佳预杂交时间;连接反应阶段设置0.5h,1h,1.5h,2h四个时间段,滚动环扩增反应阶段设置1h,2h,3h,4h四个反应时间,根据实验数据确定最佳反应时间并作为后续实验的反应条件.采用不同浓度的targetDNA,评价该检测系统的灵敏度;通过COSMIC网站查找该突变位点附近的突变,设计新的突变,以评价该检测体系检测的特异性.
3.THP-RCA检测系统的血清干扰实验
将健康成人血清按比例加入检测系统,使其血清含量分别为1%、5%,在此干扰下进行靶标物质的检测,以观察该检测体系是否受到血清物质的明显干扰.
4.THP-RCA检测系统对细胞基因组DNA的检测.
结果
1.本实验通过靶标启动的双发夹组装环化和滚动环扩增反应两步级联反应,实现STAT3基因的快速检测,具有可观的灵敏度,检测下限低至100fM,且线性范围跨度宽,线性相关系数0.9927.
2.本检测体系可以很好的检测靶标序列中的单碱基突变,对同时存在的多位点突变也可以识别,和野生型突变引起的荧光信号值有明显的区别.与野生型相比,单碱基突变引起的信号强度是野生型的55%.
结论
本研究设计的靶标启动的双发夹组装环化信号放大,结合滚动环扩增技术,能高灵敏的检测靶标,并且能够特异性地检测STAT3基因及其单碱基突变,不需要特殊仪器,在等温环境下就可以进行扩增,为肿瘤相关基因的检测提供新思路和新方法.本文首次提出靶标启动的双发夹环化思路,并通过滚动环扩增进行信号二次放大,实现超灵敏检测肿瘤相关基因,同时为等温扩增反应在生物医学领域的应用提供了新的理论基础.
核酸检测技术已广泛应用于生物医学研究,核酸(DNA和RNA)作为一种新型的检测靶标,在多种疾病的诊断和治疗中具有广泛的适用性.核酸检测技术主要通过杂交、折叠和酶催化扩增等多种技术延伸扩展而来,对生物样本中含量甚微的核酸成分检测至关重要.常见的扩增技术主要包括聚合酶链式反应(PCR),环介导温扩增技术(LAMP),链置换扩增(SDA)和滚动环扩增技术(RCA)等.随着生物医学的快速发展,PCR技术已经非常成熟,成为目前最常见的核酸扩增技术;但是PCR过程的实现具有严格的仪器、人员和环境要求,这些因素限制了PCR的临床诊断应用领域.SDA和RCA属于新型等温扩增技术,在恒温条件下对目的核酸进行扩增,相比PCR操作简单,扩增效率高且费用低廉.本研究旨在结合SDA和RCA技术设计一种新型超灵敏检测技术THP-RCA,以环状DNA为模板,从引物的3端开始扩增产生一个含有大量串联重复序列的单链DNA产物,最后通过荧光信号的读取和输出对靶标STAT3基因及其640位密码子单碱基突变进行检测,以期通过快速检测肿瘤相关基因为肿瘤的早期诊断提供新的诊断依据.
方法
1.THP-RCA检测系统的设计原理
在野生型STAT3基因存在下,靶标触发双发夹(HP1和HP2)发生环化,T4DNA连接酶催化端对端环化的HP2形成磷酸二酯键,得到环状模板.以此为复制模板,在Phi29DNA聚合酶的作用下进行扩增和信号放大,最终通过标记的荧光信号进行信号的输出.反应结束后,在492nm激发光照射下,荧光分光光度计扫描得到500nm-600nm的发射波普,以519nm处的荧光峰值来评价该检测系统对靶标的检测能力,以达到对靶标的超灵敏检测.
2.THP-RCA检测系统的评价
设计多种不同的发夹,分别组合后进行靶标检测,根据荧光强度的测定和相应信噪比的高低筛选出最佳的双发夹序列.针对反应的三个不同阶段,分别设置不同的反应时间.预杂交反应阶段设置0h,0.5h,1h,1.5h,2h五个时间段,选择信噪比最高时对应的时间点作为最佳预杂交时间;连接反应阶段设置0.5h,1h,1.5h,2h四个时间段,滚动环扩增反应阶段设置1h,2h,3h,4h四个反应时间,根据实验数据确定最佳反应时间并作为后续实验的反应条件.采用不同浓度的targetDNA,评价该检测系统的灵敏度;通过COSMIC网站查找该突变位点附近的突变,设计新的突变,以评价该检测体系检测的特异性.
3.THP-RCA检测系统的血清干扰实验
将健康成人血清按比例加入检测系统,使其血清含量分别为1%、5%,在此干扰下进行靶标物质的检测,以观察该检测体系是否受到血清物质的明显干扰.
4.THP-RCA检测系统对细胞基因组DNA的检测.
结果
1.本实验通过靶标启动的双发夹组装环化和滚动环扩增反应两步级联反应,实现STAT3基因的快速检测,具有可观的灵敏度,检测下限低至100fM,且线性范围跨度宽,线性相关系数0.9927.
2.本检测体系可以很好的检测靶标序列中的单碱基突变,对同时存在的多位点突变也可以识别,和野生型突变引起的荧光信号值有明显的区别.与野生型相比,单碱基突变引起的信号强度是野生型的55%.
结论
本研究设计的靶标启动的双发夹组装环化信号放大,结合滚动环扩增技术,能高灵敏的检测靶标,并且能够特异性地检测STAT3基因及其单碱基突变,不需要特殊仪器,在等温环境下就可以进行扩增,为肿瘤相关基因的检测提供新思路和新方法.本文首次提出靶标启动的双发夹环化思路,并通过滚动环扩增进行信号二次放大,实现超灵敏检测肿瘤相关基因,同时为等温扩增反应在生物医学领域的应用提供了新的理论基础.