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背景
结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）是分枝杆菌属中一种最主要的致病菌，其所致的结核病（Tuberculosis，TB）在世界范围内疫情回升，迄今为止仍然是严重危害人类健康的重大传染病。据世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）估计，全球约有1/3人口感染了结核分枝杆菌，在发展中国家和地区，疫情尤为严重。结核病在世界范围内有3次回升，近年来发生的第三次回升与人类免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus，HIV）感染、结核病高危人群的流动、移民问题以及耐多药结核病（Multipledrugresistanttuberculosis，MDR-TB）等多种因素有着紧密的联系。有效控制结核病的关键在于早期快速诊断结核病，有效控制传染源，研制出特异有效的疫苗。现有的诊断结核病的方法和抗结核疫苗均不理想。因此，筛选出更为优质的结核分枝杆菌蛋白抗原，提高体液免疫（血清抗体检测）和细胞免疫（γ干扰素释放试验等）诊断的准确率，以及构建新的有效疫苗，成为研究者努力的方向。
目的
分别对Rv0288（EsxH）、Rv0350（DnaK)、Rv0865（Mog）、Rv1196（PPE18）、Rv1886c（Ag85B）、Rv2351c（PlcA)、Rv2628、Rv2873（Mpt83）和Rv3418c（GroES）9个结核分枝杆菌蛋白以及1个融合蛋白CE（CFP10-ESAT-6）进行克隆表达、纯化和抗原性能评价以及评估重组蛋白在体液免疫和细胞免疫的诊断价值，为结核病免疫诊断和疫苗研究提供基础科学数据。
方法
通过基因重组和蛋白纯化技术，克隆表达和纯化上述结核分枝杆菌蛋白。通过美国国家生物信息技术中心（NationalCenterofBiotechnology，NCBI）检索出目的蛋白的基因序列，设计引物，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，PCR扩增获得目的基因，通过分子克隆方法用pET-32a与目的基因重组获得重组质粒。通过转化入BL21（DE3）感受态细胞，进行重组质粒诱导表达。随后，利用镍柱亲和层析法纯化并用BCA法测量蛋白浓度。收集人群包括结核病患者、非结核其它肺部疾病患者和健康志愿者的血液标本，以重组蛋白作抗原，采用酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）和效应T细胞酶联免疫斑点试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISPOT）分别进行人群体液和细胞免疫学检测，分析其免疫学性能。
结果
重组的10个结核分枝杆菌蛋白抗原Rv0288、Rv0350、Rv0865、Rv1196、Rv1886c、Rv2351c、Rv2628、Rv2873、Rv3418c和CE的浓度分别为155.39μg/ml、155.83μg/ml、166.82μg/ml、138.36μg/ml、185.80μg/ml、159.92μg/ml、188.17μg/ml、192.91μg/ml、174.58μg/ml和152.81μg/ml。
人群体液免疫检测，用ELISA检测135名结核病患者，56名非结核其它肺部疾病患者和94名健康人的血清特异性IgG抗体，结果显示，Rv0288、Rv0350、Rv0865、Rv1196、Rv1886c、Rv2351c、Rv2628、Rv2873、Rv3418c和CE检测的灵敏度分别为54.10％、77.80％、77.80％、76.30％、58.50％、70.37％、71.10％、76.30％、30.40％、和91.11％；特异度分别为64.00％、56.70％、60.00％、54.70％、82.00％、77.33％、64.00％、43.30％、77.30％和23.33％；准确率分别为59.30％、66.67％、68.42％、64.91％、70.88％、74.04％、67.37％、58.95％、55.09和55.44％；曲线下面积（areaundercurve，AUC）分别为0.591、0.701、0.725、0.686、0.718、0.685、0.704、0.590、0.519和0.580。除Rv3418c重组蛋白外（P＞0.05），其余9个蛋白在结核组检测到的特异性IgG抗体水平显著大于对照组（肺部病人组和健康人组），差异具有统计学意义（P＜0.05）。
细胞免疫检测，用ELISPOT检测结核病人、非结核其它肺部疾病患者和健康志愿者的外周血单核细胞被抗原刺激效应T淋巴细胞产生的γ干扰素水平，采用融合蛋白CFP10-ESAT6和Ag85B（Rv1886c）两种蛋白作参照，确定重组蛋白作为抗原的最佳刺激浓度为20.0μg/ml。ELISPOT检测结果显示Rv0288、Rv0350、Rv0865、Rv1196、Rv1886c、Rv2351c、Rv2628、Rv2873、Rv3418c和CE检测的灵敏度分别为65.52％、66.10％、12.07％、70.91％、58.93％、56.45％、36.07％、47.46％、32.86％和87.30％；特异度分别为64.57％、62.79％、91.47％、56.69％、51.94％、81.25％、75.00％、79.84％、78.74％和76.19％；准确率分别为64.86％、63.83％、66.84％、63.04％、54.05％、73.16％、62.43％、69.68％、62.44和79.89％。Rv0288、Rv0350、Rv1196、Rv1886c、Rv2351c、Rv2873和CE蛋白，在结核病人组检测到的斑点形成数（SFCs数）显著大于肺部病人组和健康对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；Rv0865、Rv2628和Rv3418c蛋白，在结核病人组检测到的SFCs数和肺部病人组和健康组相比无显著性差异（P＞0.05）。
结论
本研究成功克隆表达和纯化重组蛋白Rv0288、Rv0350、Rv0865、Rv1196、Rv1886c、Rv2351c、Rv2628、Rv2873、Rv3418c和CE融合蛋白。其中，Rv0350、Rv2873和Rv3418c尚未见相关文献报道有关其抗原性能的研究。Rv0288、Rv0350、Rv1196、Rv1886c和Rv2351c均具有较好的抗原性能，将在研究结核病免疫诊断方法和新型抗结核疫苗具有较好的潜在应用价值。
结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）是分枝杆菌属中一种最主要的致病菌，其所致的结核病（Tuberculosis，TB）在世界范围内疫情回升，迄今为止仍然是严重危害人类健康的重大传染病。据世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）估计，全球约有1/3人口感染了结核分枝杆菌，在发展中国家和地区，疫情尤为严重。结核病在世界范围内有3次回升，近年来发生的第三次回升与人类免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus，HIV）感染、结核病高危人群的流动、移民问题以及耐多药结核病（Multipledrugresistanttuberculosis，MDR-TB）等多种因素有着紧密的联系。有效控制结核病的关键在于早期快速诊断结核病，有效控制传染源，研制出特异有效的疫苗。现有的诊断结核病的方法和抗结核疫苗均不理想。因此，筛选出更为优质的结核分枝杆菌蛋白抗原，提高体液免疫（血清抗体检测）和细胞免疫（γ干扰素释放试验等）诊断的准确率，以及构建新的有效疫苗，成为研究者努力的方向。
目的
分别对Rv0288（EsxH）、Rv0350（DnaK)、Rv0865（Mog）、Rv1196（PPE18）、Rv1886c（Ag85B）、Rv2351c（PlcA)、Rv2628、Rv2873（Mpt83）和Rv3418c（GroES）9个结核分枝杆菌蛋白以及1个融合蛋白CE（CFP10-ESAT-6）进行克隆表达、纯化和抗原性能评价以及评估重组蛋白在体液免疫和细胞免疫的诊断价值，为结核病免疫诊断和疫苗研究提供基础科学数据。
方法
通过基因重组和蛋白纯化技术，克隆表达和纯化上述结核分枝杆菌蛋白。通过美国国家生物信息技术中心（NationalCenterofBiotechnology，NCBI）检索出目的蛋白的基因序列，设计引物，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，PCR扩增获得目的基因，通过分子克隆方法用pET-32a与目的基因重组获得重组质粒。通过转化入BL21（DE3）感受态细胞，进行重组质粒诱导表达。随后，利用镍柱亲和层析法纯化并用BCA法测量蛋白浓度。收集人群包括结核病患者、非结核其它肺部疾病患者和健康志愿者的血液标本，以重组蛋白作抗原，采用酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）和效应T细胞酶联免疫斑点试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISPOT）分别进行人群体液和细胞免疫学检测，分析其免疫学性能。
结果
重组的10个结核分枝杆菌蛋白抗原Rv0288、Rv0350、Rv0865、Rv1196、Rv1886c、Rv2351c、Rv2628、Rv2873、Rv3418c和CE的浓度分别为155.39μg/ml、155.83μg/ml、166.82μg/ml、138.36μg/ml、185.80μg/ml、159.92μg/ml、188.17μg/ml、192.91μg/ml、174.58μg/ml和152.81μg/ml。
人群体液免疫检测，用ELISA检测135名结核病患者，56名非结核其它肺部疾病患者和94名健康人的血清特异性IgG抗体，结果显示，Rv0288、Rv0350、Rv0865、Rv1196、Rv1886c、Rv2351c、Rv2628、Rv2873、Rv3418c和CE检测的灵敏度分别为54.10％、77.80％、77.80％、76.30％、58.50％、70.37％、71.10％、76.30％、30.40％、和91.11％；特异度分别为64.00％、56.70％、60.00％、54.70％、82.00％、77.33％、64.00％、43.30％、77.30％和23.33％；准确率分别为59.30％、66.67％、68.42％、64.91％、70.88％、74.04％、67.37％、58.95％、55.09和55.44％；曲线下面积（areaundercurve，AUC）分别为0.591、0.701、0.725、0.686、0.718、0.685、0.704、0.590、0.519和0.580。除Rv3418c重组蛋白外（P＞0.05），其余9个蛋白在结核组检测到的特异性IgG抗体水平显著大于对照组（肺部病人组和健康人组），差异具有统计学意义（P＜0.05）。
细胞免疫检测，用ELISPOT检测结核病人、非结核其它肺部疾病患者和健康志愿者的外周血单核细胞被抗原刺激效应T淋巴细胞产生的γ干扰素水平，采用融合蛋白CFP10-ESAT6和Ag85B（Rv1886c）两种蛋白作参照，确定重组蛋白作为抗原的最佳刺激浓度为20.0μg/ml。ELISPOT检测结果显示Rv0288、Rv0350、Rv0865、Rv1196、Rv1886c、Rv2351c、Rv2628、Rv2873、Rv3418c和CE检测的灵敏度分别为65.52％、66.10％、12.07％、70.91％、58.93％、56.45％、36.07％、47.46％、32.86％和87.30％；特异度分别为64.57％、62.79％、91.47％、56.69％、51.94％、81.25％、75.00％、79.84％、78.74％和76.19％；准确率分别为64.86％、63.83％、66.84％、63.04％、54.05％、73.16％、62.43％、69.68％、62.44和79.89％。Rv0288、Rv0350、Rv1196、Rv1886c、Rv2351c、Rv2873和CE蛋白，在结核病人组检测到的斑点形成数（SFCs数）显著大于肺部病人组和健康对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；Rv0865、Rv2628和Rv3418c蛋白，在结核病人组检测到的SFCs数和肺部病人组和健康组相比无显著性差异（P＞0.05）。
结论
本研究成功克隆表达和纯化重组蛋白Rv0288、Rv0350、Rv0865、Rv1196、Rv1886c、Rv2351c、Rv2628、Rv2873、Rv3418c和CE融合蛋白。其中，Rv0350、Rv2873和Rv3418c尚未见相关文献报道有关其抗原性能的研究。Rv0288、Rv0350、Rv1196、Rv1886c和Rv2351c均具有较好的抗原性能，将在研究结核病免疫诊断方法和新型抗结核疫苗具有较好的潜在应用价值。