论文部分内容阅读
研究目的
微小核糖核酸（MicroRNAs）是一类和基因表达与调控密切相关的寡核苷酸。为了了解MicroRNAs在相关肿瘤细胞内的含量，我们开发了一种基于耦连金纳米颗粒（AuNP）和脱氧核酶(DNAzyme)的纳米粒子（DNAzyme-AuNP）用于活细胞内microRNAs的原位成像。这种方法可以对活细胞内的MicroRNAs进行实时检测，为基础医学研究和临床癌症诊断提供新的检测方法。
研究方法
1.AuNPs合成
使用经过硝基盐酸（aquaregia）处理的玻璃仪器通过柠檬酸钠还原法制备13nmAuNPs，得到的13nmAuNPs通过原子力显微镜，紫外分光光度计进行表征。
2.DNAzyme-AuNPs的组装
通过三（2-羰基乙基）磷盐酸盐（TCEP）将经过巯基化修饰且标记了5-羧基荧光素(FAM)的脱氧核糖核酸底物链（substrate）进行还原，还原后的substrate和DNAzyme退火杂交，加入13nmAuNPs，盐老化，离心获得DNAzyme-AuNPs，通过紫外分光光度计表征。
3.DNAzyme-AuNPs检测目标MicroRNAs的荧光实验
3.1在DNAzyme-AuNPs中加入不同浓度目标MicroRNAs，通过荧光分光光度计检测荧光，取荧光峰值绘制与目标浓度相对应的标准曲线，确定线性检测范围。
3.2通过实时荧光检测，表征DNAzyme-AuNPs响应不同浓度目标MicroRNAs的动力学曲线。
3.3使用MiR-200家族的MicroRNAs：miR-141,miR-200b,miR-429,let-7d对DNAzyme-AuNPs的特异性识别目标MicroRNAs的能力进行表征。
3.4将DNAzyme-AuNPs中的脱氧核酶换成突变的脱氧核酶（mutantDNAzyme），合成mutantDNAzyme-AuNPs，然后加入目标MicroRNAs，表征FAM的荧光恢复是由于DNAzyme对核糖核酸（RNA）的催化裂解活性。
4.DNAzyme-AuNPs的抗降解能力和细胞毒性
4.1使用DNaseI（脱氧核糖核酸酶I）表征DNAzyme-AuNPs抗降解能力。比较四个实验组：DNAzyme-AuNPs，DNAzyme-AuNPs+DNaseI，DNAzyme-AuNPs+目标MicroRNAs，DNAzyme-AuNPs+目标MicroRNAs+DNaseI的实时荧光变化，表征DNAzyme-AuNPs的抗降解能力。
4.2MTT（四唑盐）比色法测定细胞在不同浓度DNAzyme-AuNPs下的细胞活性，表征DNAzyme-AuNPs的细胞毒性。
5.活细胞内DNAzyme-AuNPs的原位成像
5.1Hela（宫颈癌）细胞分别和DNAzyme-AuNPs，substrate-AuNPs（仅含有substrate）孵育不同时间，通过共聚焦显微镜检测荧光信号，比较两组荧光信号强弱，表征DNAzyme-AuNPs的原位成像能力。
5.2将DNAzyme-AuNPs和Hela细胞、MCF-7（人乳腺癌）细胞、L02(人正常肝)细胞孵育，比较三组的荧光信号强弱。同时用雌激素（E2）抑制MCF-7细胞内目标microRNAs表达并将未被E2处理的MCF-7细胞作为对照，将两组MCF-7细胞和DNAzyme-AuNPs孵育，比较荧光信号强弱。通过上述实验表征细胞内不同表达水平的目标RNA对DNAzyme-AuNPs活细胞内成像能力的影响。
6.DNAzyme-AuNPs的广泛适用性验证
改变DNAzyme-AuNPs中的目标识别序列，验证检测目标let-7a的可行性，动力学曲线，活细胞成像能力，表征DNAzyme-AuNPs的广泛适用性。
研究结果
1.合成的13nm的AuNPs在原子力显微镜下的高度为12-15nm，紫外分光光度计的吸收波长在518nm。组装好的DNAzyme-AuNPs紫外吸收波长在524nm。这些结果表明13nmAuNPs成功合成和脱氧核糖核酸（DNA）功能化。
2.DNAzyme-AuNPs在目标浓度为0-1nM时有较好的线性范围。动力学曲线呈现目标浓度依赖性。纳米颗粒能特异性识别靶RNA，且使用MutantDNAzyme时没有荧光信号增加。
3.DNAzyme-AuNPs在DNaseI的作用下没有明显的荧光信号增加，当目标RNA存在时有明显的荧光信号增加。
4.Hela细胞和DNAzyme-AuNPs孵育6小时后出现明显荧光信号。Hela细胞和MCF-7细胞有明显的荧光信号而L02细胞几乎没有荧光信号。雌激素处理的MCF-7细胞相对与未处理的MCF-7细胞有一个较弱的荧光信号。
5.改变目标识别序列后DNAzyme-AuNPs对另一种目标microRNAs有相似的目标识别能力和活细胞成像能力。
研究结论
1．DNAzyme-AuNPs在试管内对目标microRNAs具有高灵敏性和特异性。
2．DNAzyme-AuNPs具有较好的抗降解能力和低细胞毒性。
3．DNAzyme-AuNPs具有活细胞内MicroRNAs原位成像能力。
4．通过改变DNAzyme-AuNPs的识别序列，可以适用于不同目标microRNAs的检测。
微小核糖核酸（MicroRNAs）是一类和基因表达与调控密切相关的寡核苷酸。为了了解MicroRNAs在相关肿瘤细胞内的含量，我们开发了一种基于耦连金纳米颗粒（AuNP）和脱氧核酶(DNAzyme)的纳米粒子（DNAzyme-AuNP）用于活细胞内microRNAs的原位成像。这种方法可以对活细胞内的MicroRNAs进行实时检测，为基础医学研究和临床癌症诊断提供新的检测方法。
研究方法
1.AuNPs合成
使用经过硝基盐酸（aquaregia）处理的玻璃仪器通过柠檬酸钠还原法制备13nmAuNPs，得到的13nmAuNPs通过原子力显微镜，紫外分光光度计进行表征。
2.DNAzyme-AuNPs的组装
通过三（2-羰基乙基）磷盐酸盐（TCEP）将经过巯基化修饰且标记了5-羧基荧光素(FAM)的脱氧核糖核酸底物链（substrate）进行还原，还原后的substrate和DNAzyme退火杂交，加入13nmAuNPs，盐老化，离心获得DNAzyme-AuNPs，通过紫外分光光度计表征。
3.DNAzyme-AuNPs检测目标MicroRNAs的荧光实验
3.1在DNAzyme-AuNPs中加入不同浓度目标MicroRNAs，通过荧光分光光度计检测荧光，取荧光峰值绘制与目标浓度相对应的标准曲线，确定线性检测范围。
3.2通过实时荧光检测，表征DNAzyme-AuNPs响应不同浓度目标MicroRNAs的动力学曲线。
3.3使用MiR-200家族的MicroRNAs：miR-141,miR-200b,miR-429,let-7d对DNAzyme-AuNPs的特异性识别目标MicroRNAs的能力进行表征。
3.4将DNAzyme-AuNPs中的脱氧核酶换成突变的脱氧核酶（mutantDNAzyme），合成mutantDNAzyme-AuNPs，然后加入目标MicroRNAs，表征FAM的荧光恢复是由于DNAzyme对核糖核酸（RNA）的催化裂解活性。
4.DNAzyme-AuNPs的抗降解能力和细胞毒性
4.1使用DNaseI（脱氧核糖核酸酶I）表征DNAzyme-AuNPs抗降解能力。比较四个实验组：DNAzyme-AuNPs，DNAzyme-AuNPs+DNaseI，DNAzyme-AuNPs+目标MicroRNAs，DNAzyme-AuNPs+目标MicroRNAs+DNaseI的实时荧光变化，表征DNAzyme-AuNPs的抗降解能力。
4.2MTT（四唑盐）比色法测定细胞在不同浓度DNAzyme-AuNPs下的细胞活性，表征DNAzyme-AuNPs的细胞毒性。
5.活细胞内DNAzyme-AuNPs的原位成像
5.1Hela（宫颈癌）细胞分别和DNAzyme-AuNPs，substrate-AuNPs（仅含有substrate）孵育不同时间，通过共聚焦显微镜检测荧光信号，比较两组荧光信号强弱，表征DNAzyme-AuNPs的原位成像能力。
5.2将DNAzyme-AuNPs和Hela细胞、MCF-7（人乳腺癌）细胞、L02(人正常肝)细胞孵育，比较三组的荧光信号强弱。同时用雌激素（E2）抑制MCF-7细胞内目标microRNAs表达并将未被E2处理的MCF-7细胞作为对照，将两组MCF-7细胞和DNAzyme-AuNPs孵育，比较荧光信号强弱。通过上述实验表征细胞内不同表达水平的目标RNA对DNAzyme-AuNPs活细胞内成像能力的影响。
6.DNAzyme-AuNPs的广泛适用性验证
改变DNAzyme-AuNPs中的目标识别序列，验证检测目标let-7a的可行性，动力学曲线，活细胞成像能力，表征DNAzyme-AuNPs的广泛适用性。
研究结果
1.合成的13nm的AuNPs在原子力显微镜下的高度为12-15nm，紫外分光光度计的吸收波长在518nm。组装好的DNAzyme-AuNPs紫外吸收波长在524nm。这些结果表明13nmAuNPs成功合成和脱氧核糖核酸（DNA）功能化。
2.DNAzyme-AuNPs在目标浓度为0-1nM时有较好的线性范围。动力学曲线呈现目标浓度依赖性。纳米颗粒能特异性识别靶RNA，且使用MutantDNAzyme时没有荧光信号增加。
3.DNAzyme-AuNPs在DNaseI的作用下没有明显的荧光信号增加，当目标RNA存在时有明显的荧光信号增加。
4.Hela细胞和DNAzyme-AuNPs孵育6小时后出现明显荧光信号。Hela细胞和MCF-7细胞有明显的荧光信号而L02细胞几乎没有荧光信号。雌激素处理的MCF-7细胞相对与未处理的MCF-7细胞有一个较弱的荧光信号。
5.改变目标识别序列后DNAzyme-AuNPs对另一种目标microRNAs有相似的目标识别能力和活细胞成像能力。
研究结论
1．DNAzyme-AuNPs在试管内对目标microRNAs具有高灵敏性和特异性。
2．DNAzyme-AuNPs具有较好的抗降解能力和低细胞毒性。
3．DNAzyme-AuNPs具有活细胞内MicroRNAs原位成像能力。
4．通过改变DNAzyme-AuNPs的识别序列，可以适用于不同目标microRNAs的检测。