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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H. pylori)是一种螺旋状、微需氧革兰阴性杆菌,主要定植于人胃粘膜,已造成全球50%以上人口感染。H. pylori感染是慢性胃炎、消化性溃疡及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因子,与胃癌的发生密切相关,已被WHO列为Ⅰ类致癌因子。H. pylori感染可以引起机体较强烈的天然和获得性免疫应答,但自然感染H. pylori后的免疫反应并不能清除细菌,反而由于持续感染导致胃粘膜免疫病理损害。目前,H. pylori慢性持续性感染的机理仍不十分清楚。CD4+T细胞即Th细胞在H. pylori感染的免疫应答中发挥重要作用,Th细胞被激活后,通过不同的分化途径分化为效应性Th细胞,获得特定的生物学功能,根据其产生细胞因子和生物学功能的不同,传统上将效应性CD4+T细胞分为Th1和Th2亚群。H. pylori感染通常表现为粘膜组织内特异性CD4+T细胞增加,T细胞主要产生IL-2、IFN-γ、IL-12等细胞因子,提示为Thl型免疫应答。现多认为Thl型免疫应答参与了H. pylori感染慢性炎症的进程,并导致胃粘膜损伤甚至溃疡,但仅仅Th1型免疫应答并不能完全解释H. pylori感染后胃炎的发生。近年研究发现一类不同于Th1和Th2细胞的Th细胞亚群,此细胞亚群分泌IL-17、IL-6,IL-22和IL-21,而不分泌IL-4和IFN-γ,被命名为Th17细胞亚群。Thl7细胞主要介导慢性炎症,在自身免疫病、炎症性疾病及防御粘膜胞外菌感染中发挥重要作用。Thl7细胞的发现及其分化和功能的研究,有助于我们对以慢性炎症为机制的疾病的理解和阐明,为慢性炎症疾病的免疫防治提供了新的思路。那么Th17细胞在H. pylori感染过程中呈现什么样的应答规律,在H. pylori感染中发挥什么样的功能呢?目前还不清楚。【研究目的】1.本研究拟以Th17细胞及其主要效应因子IL-17作为研究的主要对象,研究其在H. pylori感染中的应答规律;2.初步明确Th17细胞在H. pylori慢性感染中的作用及初步机制探讨。【研究方法】1.建立H. pylori感染BALB/c小鼠模型,在H. pylori感染后不同时间点处死小鼠,取胃组织提取RNA检测细胞因子mRNA水平变化,提取胃组织蛋白,ELISA检测细胞因子蛋白水平变化,取小鼠的脾,肠系膜淋巴结,胃旁淋巴结分离淋巴细胞后,细胞内因子染色,FCM检测Th1,Th2和Th17细胞应答。2.基因工程方法制备GST-IL-17融合蛋白,免疫家兔制备抗IL-17抗体,鉴定其中和IL-17的活性。口服灌胃H. pylori前腹腔注射抗IL-17抗体,real-time PCR检测阻断IL-17效应后H. pylori定植量的变化,H&E染色检测胃组织炎症;并采用AdmIL-17口服灌胃后感染H. pylori,检测调控IL-17高表达对H. pylori定植量及胃组织炎症的影响。3.培养小鼠胃上皮细胞(MFC),加入IL-17刺激24 h,收集细胞,抽提RNA,real-time PCR检测基质金属蛋白酶(MMP )和趋化因子的变化,并在上述IL-17阻断和高表达模型中检测MMP和趋化因子的变化。【研究结果】1. Th17细胞及相关细胞因子在H. pylori感染中的应答规律1.1 H. pylori感染组的小鼠胃组织中IFN-γ和IL-17的表达在mRNA及蛋白水平均显著增高,而IL-4的表达在蛋白水平没有显著的变化。调控Th1和Th17细胞应答的细胞因子IL-12和IL-23的表达在H. pylori感染后也有显著升高。1.2通过流式细胞技术检测Th细胞的频率发现:H. pylori感染小鼠的脾淋巴细胞中H. pylori特异性的Th1和Th17细胞的比率显著高于正常小鼠的脾淋巴细胞,而Th2细胞应答变化不显著。提示H. pylori感染可以诱导特异性的Th1和Th17细胞应答。1.3 Th细胞应答呈现动态变化:H. pylori感染后7 d,在肠系膜淋巴结检测到Th1,Th2及Th17细胞的应答,在脾淋巴细胞中,Th17细胞在14 d开始增多,21 d达到高峰,Th1细胞在21 d开始增多,而Th2细胞在整个感染进程中没有显著变化。在胃旁淋巴结中Th细胞的应答较晚在28 d出现应答,其Th1及Th17细胞应答的规律与脾的情况类似。脾和胃旁淋巴结的淋巴细胞中Th细胞应答显示Th17细胞应答要早于Th1细胞应答,并且不同淋巴器官中Th细胞应答的时间提示肠系膜淋巴结可能是H. pylori激发特异性免疫应答较早的场所。2. Th17/IL-17促进H. pylori的定植以及胃组织炎症2.1兔抗IL-17抗体处理组的小鼠H. pylori定植量及胃组织炎症显著均显著低于对照IgG处理组小鼠(P < 0.05)。结果提示中和IL-17的活性有助于H. pylori的清除并减轻炎症,说明Th17/IL-17途径可能削弱了抗H. pylori感染的宿主防御。2.2我们采用AdmIL-17感染胃组织上调IL-17的表达后再感染H. pylori,检测H. pylori定植量和胃组织炎症的变化。AdmIL-17处理小鼠,与AdLuc和PBS处理组相比,在H. pylori感染后显著增加H. pylori的定植量(P < 0.01),而AdLuc处理组与PBS处理组相比,H. pylori的定植量没有显著变化(P > 0.05)。H&E染色切片显示,AdmIL-17组小鼠胃组织炎症程度强于AdLuc处理组(P < 0.0125),而AdLuc处理组小鼠的胃粘膜炎症与PBS组相比没有显著性变化(P > 0.05)。这些结果显示Th17 / IL-17可能增加了宿主对H. pylori感染的敏感性。3. Th17细胞/IL-17在H. pylori感染中的作用机制初探3.1小鼠胃上皮细胞系MFC细胞在IL-17的刺激下,MMP-2,MMP-3,MMP-7,MMP-9和趋化因子CCL2,CCL5,CCL20,CCL25以及CXCL1等mRNA表达与未刺激的细胞相比均显著增高(P < 0.05)。提示MMP和趋化因子可能参与了H. pylori感染中IL-17介导的免疫效应。3.2 IL-17抗体处理后H. pylori感染胃组织中MMP-9和CCL25的表达与对照IgG处理小鼠相比显著降低(P < 0.05),而其他MMP和趋化因子的表达没有显著变化。3.3 AdmIL-17处理后H. pylori感染组,与AdLuc和PBS处理组相比,MMP-2, MMP-9和CCL25的表达显著增高(P < 0.05)。以上结果提示我们Th17细胞及IL-17可能通过诱导MMP-9以及CCL25的表达参与调控H. pylori感染及炎症反应。【主要结论】1. H. pylori感染后可以诱导H. pylori特异性的Th1和Th17细胞应答。Th17细胞应答要早于Th1细胞应答,并且不同淋巴器官中Th细胞应答的时间提示肠系膜淋巴结可能是H. pylori激发特异性免疫应答较早的场所。2. Th17/IL-17可以促进H. pylori感染后的细菌定植以及炎症的程度。3. Th17/IL-17可能是通过调控MMP以及趋化因子的表达参与H. pylori感染后的细菌定植以及炎症的调控。【研究意义】Th17/IL-17可能成为H. pylori感染相关疾病辅助治疗的靶标,深入了解H. pylori感染后Th细胞免疫应答特征,功能及其调控,将有助于我们更全面了解H. pylori感染的致病机制,并且有助于指导H. pylori相关免疫疾病的免疫治疗。