论文部分内容阅读
背景和目的:糖尿病是一种复杂的代谢失调疾病,但临床上关于糖尿病的总体疗效仍不理想,糖尿病致残率和致死率依然很高,因而寻找有效的药物意义深远,中药含有多种有效成分可以高效保护胰岛β细胞,调节糖脂代谢和信号通路,降低血糖,改善胰岛素抵抗,对糖尿病及其并发症有显著的疗效。新近研究发现O-Glc NAc糖基化修饰异常与糖脂代谢紊乱密切相关。本课题构建了胰岛β细胞O-Glc NAcase(OGA)特异性敲除小鼠模型,分别在常规饲养条件下和高糖饮水条件下观察小鼠胰岛β细胞OGA敲除(Knockout,KO)小鼠对糖代谢的影响,为深入研究中药的降糖作用和开发降糖新药提供合适的动物模型,对以后评价中药以及中药单体对于糖尿病的疗效作出更加准确的研究基础。方法:1.运用Cre-Lox P重组酶系统构建胰岛β细胞OGA特异性敲除小鼠模型,并运用琼脂糖凝胶电泳和免疫组织化学染色法验证基因敲除效果。2.分别在常规饮食条件下和高糖饮水条件下,通过空腹血糖和体重监测,以及腹腔注射葡萄糖耐量实验(Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)、腹腔注射胰岛素耐量实验(Intraperitoneal insulin tolerance test,IPITT)观察胰岛β细胞OGA缺失对葡萄糖代谢稳态及胰岛素敏感性的影响。3.通过血清多因子检测试剂盒检测胰岛素、胰高血糖素等多项代谢相关内分泌调节激素水平。4.代谢笼监测小鼠代谢特征改变,包括呼吸交换率、活动量、进食量、饮水量等指标。5.通过16S r DNA测序观察小鼠肠道微生态的改变。结果:1.琼脂糖凝胶电泳和免疫组化结果显示,与野生(Wild type,WT)对照小鼠相比,KO组小鼠胰岛β细胞OGA基因敲除,OGA蛋白表达水平显著降低,O-Glc NAc糖基化表达水平升高;TUNEL染色发现KO组胰岛内凋亡细胞比例增加。2.常规饲养小鼠血糖及体重监测显示,年轻小鼠KO组血糖与WT组差异不明显,老龄时KO组血糖则显著高于WT组血糖(P<0.05);年轻小鼠KO组与WT组相比体重偏低,并于老龄时体重显著大于WT组(P<0.05);KO组糖耐量曲线下面积显著大于WT组(P=0.012),IPGTT显示KO组糖耐量受损,但IPITT两组间差异不显著;小鼠血清代谢相关内分泌调节激素检测,KO组胰岛素均值为1899.8 ng/m L,WT组胰岛素均值为4274.0 ng/m L,KO组较WT组显著减低(P=0.017);KO组瘦素均值为1014.7 ng/m L,WT组小鼠瘦素均值为375.5 ng/m L,KO组瘦素较WT组显著升高(P=0.045),而两组间胰高血糖素、抵抗素等其他6项代谢相关内分泌调节激素未见显著性差异(P>0.05);进一步代谢笼监测结果显示,KO组小鼠消耗量、二氧化碳生成量、产热、进食量和饮水量较WT组均显著增加(P<0.05)。3.高糖饮水小鼠血糖和体重变化趋势与常规饲养小鼠趋势相一致,KO组血糖和体重上升更加迅速;高糖饮水24周后,KO组胰岛素耐量曲线下面积显著大于WT组(P=0.005),IPITT实验结果显示,KO组胰岛素敏感性显著降低;高糖饮水小鼠血清代谢相关内分泌调节激素检测发现,高糖饮水4周后,KO组胰岛素均值为3158.5ng/m L,WT组胰岛素均值为6956.5 ng/m L,KO组胰岛素较WT组显著减低(P=0.040),KO组瘦素均值为1119.0 ng/m L,WT组瘦素均值为534.9 ng/m L,KO组小鼠瘦素较WT组显著升高(P=0.018),此外,KO组小鼠血清胰高血糖素较WT组小鼠显著减低(P=0.0148),抵抗素较WT组小鼠显著升高(P=0.041)。对高糖饮水4周小鼠进行代谢笼监测发现,KO组小鼠摄食、饮水量较WT组均显著增加(P<0.05)。4.16S r DNA测序结果WT组小鼠比KO组小鼠菌群分布较均匀,与常规饲养小鼠相比高糖饮水后小鼠菌群群落变得更加复杂。同时在分类分析情况中门水平上KO组小鼠Bacteroidetes/Firmicutes(F/B)高,Bacteroidetes减少,Firmicutes增多。结论:1.胰岛β细胞OGA特异性敲除小鼠O-Glc NAc糖基化水平升高,胰岛β细胞功能受损,胰岛素分泌减低,糖耐量异常。2.高糖饮水诱导条件下,胰岛β细胞OGA特异性敲除小鼠糖代谢紊乱更加显著。3.高糖饮水后胰岛β细胞OGA特异性敲除小鼠加重了糖代谢紊乱从而使菌群群落变得更加复杂,出现某些与代谢紊乱相关菌群表达丰度改变,提示小鼠肠道菌群失调可能与胰岛β细胞OGA特异性敲除小鼠糖代谢紊乱密切相关。