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研究背景及目的淋巴瘤是目前发病率最高的血液恶性肿瘤,严重威胁人类健康。淋巴瘤异质性强,病理分型复杂。弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是其中最常见的亚型,发病率约占所有淋巴瘤30%。R-CHOP方案作为标准一线方案应用临床,明显改善了DLBCL患者的疗效和生存,但复发难治(R/R)DLBCL仍然是临床面临的棘手问题。免疫治疗的临床应用,尤其是免疫检查点治疗和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T)的突破性进展,给R/R DLBCL患者带来新的希望。程序性细胞死亡1受体(PD-1)是关键的免疫检查点分子之一。PD-1单抗治疗R/R霍奇金淋巴瘤的总反应率高达90%。然而,目前PD-1单抗治疗DLBCL的临床数据尚不多见,有待进一步探索和研究。此外,当前CAR-T治疗R/R DLBCL的临床试验也正在国内外广泛开展中。T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)是另一个重要的免疫检查点分子。文献报道,PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞诱导性表达TIM-3上调,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。本课题关注于免疫治疗R/R DLBCL,拟探究T细胞表达PD-1水平对于DLBCL的临床意义;分析PD-1靶向阻断策略(PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞)临床治疗R/R DLBCL患者的疗效、安全性、预测生物标记物及耐药机制;并进一步探索PD-1单抗和TIM-3单抗联合治疗B系淋巴瘤的疗效和免疫学机制,为未来相关临床应用提供实验基础。研究方法(1)应用流式细胞仪检测DLBCL患者外周血(40例)和淋巴结(30例)T细胞亚群分布及其细胞表面PD-1表达情况;应用ELISA方法检测患者血浆(40例)可溶性PD-1及PD-L1水平及动态演变。将患者的上述指标与对照组(正常人群及淋巴结反应性增生患者)对比,分析PD-1(膜表达和可溶性表达)以及可溶性PD-L1在DLBCL发病机制中的作用;对DLBCL患者进行临床特征(病理亚型,IPI评分)亚组分析和生存分析,以进一步探究PD-1/PD-L1对DLBCL患者临床特征和生存的影响。(2)应用PD-1靶向阻断策略(PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞)治疗R/R DLBCL患者,观察疗效和毒副反应情况;并应用外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片和免疫组化技术对患者淋巴结组织进行检测,以探寻PD-1靶向治疗相关的预测生物标记物;应用流式细胞仪监测患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3的动态变化,以进一步探究PD-1靶向治疗耐药与耗竭T细胞可能的相关机制。(3)建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型,观察肿瘤成瘤率及生长速度;分别应用阻断性PD-1单抗单药和PD-1单抗+TIM-3单抗联合方案治疗成瘤小鼠,观察各组治疗效果和生存情况;并应用CD8+磁珠分选、流式细胞仪、ELISA、CCK8等方法进一步探究PD-1+TIM-3单抗联合方案治疗的免疫学机制。研究结果(1)与正常对照组相比,初诊DLBCL患者外周血CD4+T细胞占CD3+T细胞的比例明显下降(45.47±10.07%VS.61.91±10.52%,P=0.036),而CD8+T细胞比例则相应升高(43.99±9.32%VS.31.94±6.50%,P=0.045),且CD4+T细胞及CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调(CD4+PD-1+:16.30±4.58%VS.8.96±2.95%,P=0.017;CD8+PD-1+:18.12±5.43%VS.10.13±3.30,P=0.023)。与淋巴结反应性增生患者相比,DLBCL患者淋巴结CD3+T细胞比例明显下降(23.55±15.62%VS.56.65±10.36%,P=0.002);CD4+和CD8+T细胞占CD3+T细胞的比例差异无显著性(P>0.05),但CD4+和CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调(CD4+PD-1+:45.95±11.61%VS.18.26±3.61%,P=0.001;CD8+PD-1+:55.11±13.45%VS.19.32±3.78%,P=0.001)。与正常对照组相比,DLBCL患者初诊时血浆可溶性PD-1明显上升(4.49±3.53ng/ml VS.0.47±0.36ng/ml,P=0.002),PD-L1水平也明显上升(1.21±1.03ng/ml VS.0.26±0.24ng/ml,P=0.039)。对DLBCL患者进行临床特征亚组分析显示PD-1(膜表达和可溶性表达)以及可溶性PD-L1水平和患者临床特征(病理亚型,IPI评分)相关;生存分析显示PD-1(膜表达和可溶性表达)以及可溶性PD-L1高表达组的OS和PFS均明显低于低表达组(P<0.05);动态分析患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平显示,其与患者病情状态密切相关。(2)应用PD-1靶向阻断策略(PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞)治疗R/R DLBCL,部分患者获得了明显疗效(PD-1单抗治疗ORR达33%;PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞治疗ORR达72%),总体耐受性好,毒副反应较轻;外显子基因捕获二代测序和寡核苷酸阵列芯片分析提示患者肿瘤染色体及基因突变程度高者对PD-1单抗治疗更加敏感(P<0.05);免疫组化提示肿瘤浸润T细胞数量或/和PD-L1表达高者,对PD-1单抗治疗反应更好(P<0.05)。患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3呈动态变化,随着PD-1单抗治疗的进行,T细胞PD-1表达下调,但TIM-3表达上调,且疗效不佳组患者T细胞表达TIM-3上调更加明显(CD4+TIM-3+:29.12±3.52%VS.20.10±2.71%,P=0.001;CD8+TIM-3+:30.12±3.65%VS.19.93±3.52%,P=0.001)。(3)成功建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型;PD-1单抗+TIM-3单抗联合组疗效和生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组;免疫学机制研究提示:PD-1单与PD-1单抗单药组和对照组相比,PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞浸润增加(30.12±2.15%VS.14.94±1.42%VS.4.99±0.95%,P=0.001),且其TIM-3表达明显下调(20.55±1.46%VS.60.14±2.98%VS.40.01±2.52%,P=0.001);体外T细胞功能学实验提示PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞增殖及杀伤能力明显强于PD-1单抗单药组和对照组(P<0.05);凋亡明显低于另外两组(P<0.05);PD-1+TIM-3单抗联合组血浆IL-2、IFN-γ及TNF-α动态水平也明显高于另外两组(P<0.05)。结论(1)DLBCL患者T细胞表达PD-1上调和血浆可溶性PD-1/PD-L1水平升高在DLBCL发病机制中发挥重要作用;上述指标与患者临床特征(病理亚型,IPI评分)及生存(OS/PFS)密切相关;患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平动态变化与其病情状态密切相关,可将其作为DLBCL病情监测的潜在生物标记物。(2)应用PD-1靶向阻断策略(PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞)治疗R/R DLBCL总体耐受性好,毒副反应较轻,但仅对部分患者有效;外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片分析及免疫组化分析提示:患者肿瘤突变程度、肿瘤浸润T细胞数量和肿瘤微环境PD-L1表达等因素,与PD-1单抗疗效密切相关,提示上述指标有可能成为预测PD-1单抗疗效的潜在生物标记物;PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞将诱导性上调TIM-3分子表达,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。(3)BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型中,PD-1单抗+TIM-3单抗联合组的疗效及生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组,从而提示:PD-1单抗和TIM-3单抗联合应用能够发挥更强的抗肿瘤作用。免疫学机制研究进一步揭示:PD-1+TIM-3单抗联合可以抑制效应T细胞的TIM-3诱导性表达,并通过增强CD8+T细胞增殖及杀伤能力、抑制CD8+T细胞凋亡、上调多种因子表达(IL-2、IFN-γ及TNF-α)等机制,避免T细胞耗竭从而增强T细胞抗肿瘤效应。