锌指蛋白OsZFP207调控水稻生长发育的机理研究

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水稻是人类最重要的粮食作物之一,不仅在农业生产和粮食安全中发挥着重要作用,也是单子叶植物分子生物学研究的模式植物,备受科学家们关注。株高是水稻的重要农艺性状,对水稻株高形成的分子机理研究有助于培育具有理想株型、高产、耐逆等优良品种。研究表明,植物株高受到多种激素调控,也受光温等环境因素影响,但植物株高调控的分子机理和基因网络仍需更多研究去补充、阐明。本研究在实验室前期研究工作的基础上,分析了水稻C2H2型单锌指蛋白OsZFP207调控水稻株高的机理。主要研究结果如下:1)通过SMART软件分析发现水稻锌指蛋白OsZFP207只含有一个C2H2型锌指结构域,属于C2H2型单锌指蛋白。通过ENSEMBL网站分析,发现OsZFP207基因只存在于单子叶植物,包括各种野生稻和栽培稻中,是单子叶植物特有的锌指蛋白;同源蛋白进化树和氨基酸比对分析表明,OsZFP207在不同物种中高度保守。通过ENSEMBL网站分析OsZFP207的组织表达特性,发现OsZFP207在水稻多数组织中表达量较低,但在茎秆组织和愈伤组织中表达量较高。利用RAP-DB数据库分析OsZFP207的时空表达特性,发现该基因在在水稻根和叶鞘中表达量较高,在种子形成过程中的表达量是逐渐升高的。实时荧光定量PCR方法分析OsZFP207的表达特性,结果表明OsZFP207基因受盐、干旱和低温等多种非生物胁迫诱导表达。利用烟草叶表皮细胞进行亚细胞定位分析,结果表明OsZFP207蛋白定位于细胞核中。2)以粳稻(Oryza sativa subs.japonica L.)中花11为受体,利用农杆菌介导的转基因技术获得OsZFP207干涉抑制表达(RNA interference)和过量表达(Over-expression)转基因株系。比较温室和大田生长条件下转基因株系和野生型的苗高或株高的增长速率,发现OsZFP207过量表达转基因株系的苗高或株高的增长速率低于野生型,而OsZFP207干涉抑制表达转基因株系的苗高或株高的增长速率较野生型略高或相似。比较转基因株系和野生型成熟期的农艺性状,发现与野生型相比,OsZFP207过量表达的三个转基因株系均表现出株高变矮、分蘖数减少、穗长变短、粒长和粒宽下降、千粒重降低,出现不同程度包穗的表型;而干涉抑制表达的三个转基因株系的各性状与野生型相近,只是分蘖数和一次枝梗数略有增多。测定水稻各节间长度,结果表明,OsZFP207过量表达转基因株系的矮化主要是由第一和第二节间的显著缩短导致的。扫描电镜发现OsZFP207过量表达转基因株系的颖果外稃表皮细胞长和宽均较野生型显著变小,而OsZFP207干涉抑制表达转基因株系仅颖果外稃表皮细胞长较野生型变长。微分干涉差显微观察发现OsZFP207过量表达转基因株系苗期叶片表皮细胞显著小于野生型,而OsZFP207干涉抑制表达转基因株系苗期叶片表皮细胞显著大于野生型。种子发芽试验结果表明,OsZFP207过量表达转基因株系在正常条件下发芽速率、成苗率和发芽指数显著低于野生型对照中花11,而干涉抑制表达转基因株系种子活力与野生型相似。利用http://www.rmbreeding.cn/snp3k公布的3000份水稻测序资源对OsZFP207进行SNP分析,发现该基因共有4个SNP突变位点,均位于外显子上;以样本数≥50为阈值,该基因有4个主要单倍型,利用它们进行单倍型分析发现,OsZFP207与水稻株高、穗长和叶舌长度相关性最大。说明在水稻自然群体中存在调控株高的OsZFP207的等位变异。3)内源植物激素含量的测定结果表明,与野生型相比,OsZFP207过量表达转基因株系的赤霉素含量显著下调,而OsZFP207干涉抑制表达转基因株系赤霉素含量显著上调;对OsZFP207过量表达转基因株系和野生型进行转录组测序分析,结果表明,过量表达转基因株系中多个赤霉素合成相关的基因包括“绿色革命”基因OsGA20ox2/SD1的表达量较野生型下调。酵母单杂交和EMSA分析表明OsZFP207蛋白可以与OsGA20ox2的启动子序列中包含DBS(DST binding site)靠近起始密码子ATG的区段结合;进一步利用ChIP-qPCR技术,在植物体内证实了 ZFP207蛋白可以结合赤霉素合成关键基因OsGA20ox2的启动子。4)生物信息学分析发现OsZFP207的表达量也受细胞分裂素、脱落酸、茉莉酸和赤霉素等外源激素影响,其中细胞分裂素处理下,该基因在水稻根部表达量变化最大。过量表达转基因株系和野生型的转录组测序分析,也发现多个与细胞分裂素、细胞分裂和生长素相关基因的表达量发生显著变化,利用实时荧光定量PCR分析方法,进一步验证了与细胞分裂相关的OsCycB2;2、OsCDKB2;1基因和与细胞分裂素信号转导通路相关的OsRR5、OsRR6和WOX11等基因在OsZFP207过量表达转基因株系中的表达量较野生型上调,在干涉抑制表达转基因株系表达量下调。
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