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在过去的几十年里,心血管疾病的预防、诊断和治疗方面已经有了非常重大的进展。然而,心血管疾病仍然是威胁人民健康的头号杀手。近年来的统计数字表明,全世界新发心血管疾病患者人数逐年增高,虽然随着介入技术的逐步普及,大大提高了心血管疾病患者的生存率,但心血管疾病的死亡率仍占总死亡率的三分之一左右。我国的心血管患病率依然处于持续上升阶段。心肌缺血时冠状动脉循环受损可导致严重的缺氧损伤。通过溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)快速恢复冠状动脉血流对于限制心肌梗死面积的扩大、保留左心射血功能和防止左心室重构至关重要。通过溶栓治疗或PCI进行血运重建可将心脏病发作患者的死亡率降低近50%。然而,血运重建后含氧量高的血液恢复会加重缺血组织损伤,这种现象被称为缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/RI)。缺血/再灌注损伤的概念是在1960年由Jennings等人首次提出的。研究发现,心脏缺血/再灌注损伤与细胞内钙超载、氧化应激、血管内皮细胞损伤和细胞凋亡等有关。这促使人们寻找新的治疗策略来保护心脏免受I/RI损伤,从而改善心肌梗死患者的预后。Micro RNA(mi RNA)是一类由22个碱基左右组成的、内源性的非编码的单链小分子RNA,通过对m RNA的降解或者翻译抑制在转录后水平负调控靶基因的表达。近年来多项研究发现mi RNA参与了心肌重塑、心肌肥厚、心肌细胞凋亡、心律失常、心力衰竭等心血管系统的病理生理过程,尤其是在心脏缺血/再灌注损伤中的调控作用,越来越受到人们的重视。研究发现,在心脏缺血/再灌注损伤的小鼠体内注入mi R-1,mi R-21和mi R-24可以减少心肌梗死范围。Ren等研究发现,mi R-320在心脏缺血/再灌注损伤中表达明显降低,敲除mi R-320可以使热休克蛋白20(heatshock protein 20,Hsp20)表达增加,从而减少心脏缺血/再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡。本研究分别以急性心肌梗死病人血浆、乳大鼠原代心肌细胞和H9C2心肌细胞为研究对象。分别应用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白印迹法(Western Blot)、MTS实验、LDH实验、流式细胞术和免疫共沉淀等实验方法研究心肌缺血再灌注损伤情况下mi R-199a-5p的表达;然后通过体外实验研究过表达或敲低mi R-199a-5p后对心肌细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤情况下的细胞活力和LDH释放、细胞凋亡及线粒体膜电位水平的影响,最后通过检测相关通路蛋白的表达情况进一步探讨其影响心肌缺血再灌注损伤的途径,阐明了mi R-199a-5p在心肌缺血再灌注损伤的作用,从而为更深刻的认识心肌缺血再灌注损伤发生发展的分子机制。第一部分心肌缺血再灌注损伤时mi R-199a-5p的表达目的:验证mi R-199a-5p在心肌梗死患者和心肌细胞中的表达。方法:1.RT-PCR法检测19例男性心肌梗死患者和23例男性对照组血浆中mi R-199a-5p的表达水平。2.RT-PCR法检测乳大鼠原代心肌细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤时mi R-199a-5p的表达水平。3.RT-PCR法检测H9C2心肌细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤时mi R-199a-5p的表达水平。结果:1.RT-PCR结果显示:与对照组相比,mi R-199a-5p在心肌梗死组表达水平显著增高,差异具有统计学意义。2.与对照组相比,糖氧剥夺复氧复糖处理后原代心肌细胞及H9C2细胞中mi R-199a-5p表达升高(P<0.05)。小结:mi R-199a-5p在心肌缺血再灌注损伤情况下中表达显著增高。第二部分mi R-199a-5p对H9C2细胞株糖氧剥夺复氧复糖凋亡的影响目的:研究过表达和敲低mi R-199a-5p对糖氧剥夺复氧复糖损伤状态下H9C2心肌细胞细胞活力和细胞凋亡等功能的影响。方法:1.构建过表达和敲低H9C2细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤细胞模型。2.MTS实验和LDH实验检测过表达mi R-199a-5p对糖氧剥夺复氧复糖损伤对H9C2细胞细胞活力的影响。过表达mi R199a-5p可以降低H9C2细胞HIF-1α、P-GSK3β/GSK3β蛋白的表达3.MTS实验和LDH实验检测敲低mi R-199a-5p对糖氧剥夺复氧复糖损伤H9C2细胞的细胞活力的影响。4.TUNEL实验检测敲低mi R-199a-5p对糖氧剥夺复氧复糖损伤H9C2细胞凋亡的影响。5.采用流式细胞术检测敲低mi R-199a-5p对糖氧剥夺复氧复糖损伤H9C2细胞的线粒体通透性转换孔的影响。结果:1.成功构建过表达和敲低mi R-199a-5p的H9C2心肌细胞模型。2.MTS与LDH实验结果显示过表达mi R-199a-5p对糖氧剥夺复氧复糖条件下H9C2细胞细胞培养中细胞活力明显低于糖氧剥夺复氧复糖组。3.MTS与LDH实验结果显示,敲低mi R-199a-5p可以减轻糖氧剥夺复氧复糖对H9C2细胞株细胞活力的影响。4.TUNEL实验结果显示,敲低mi R-199a-5p能够减轻H9C2细胞糖氧剥夺复氧复糖所致的细胞凋亡。5.流式细胞学实验结果显示,敲低mi R-199a-5p能够减轻H9C2细胞糖氧剥夺复氧复糖所致的线粒体膜电位水平的下降。小结:1.过表达mi R-199a-5p能够加重H9C2心肌细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤。2.敲低mi R-199a-5p能够减轻H9C2心肌细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤。第三部分mi R-199a-5p通过HIF-1α/P-GSK3β/mPTP轴影响心肌细胞缺血再灌注损伤目的:预测并验证mi R-199a-5p的靶基因,进一步研究mi R-199a-5p在心肌缺血再灌注损伤过程中的细胞功能的分子生物学机制。方法:1.通过Targetscan、MIRBase和MIRDB等mi RNA靶基因预测数据库,在线预测mi R-199a-5p可能的靶基因。2.在细胞水平上通过双荧光素酶报告基因验证mi R-199a-5p的靶基因及参与的信号通路。3.通过si RNA转染技术来干预HIF-1α的蛋白表达,进而采用Western Blot等方法来验证mi R-199a-5p与HIF-1α/P-GSK3β/m PTP轴之间的靶点调控关系。4.采用免疫细胞化学染色的方法来定性检测敲低mi R-199a-5p对P-GSK3β与ANT的影响。5.采用免疫共沉淀的方法来定量检测敲低mi R-199a-5p后P-GSK3β与ANT以及CYP-D三者之间的关系。结果:1.预测mi R-199a-5p的靶基因:通过mi RNA靶基因预测数据库预测mi R-199a-5p的靶基因,三个软件交集的mi R-199a-5p靶基因并选择1个靶基因作为mi R-199a-5p的可能靶基因来进一步研究。2.mi R-199a-5p双萤光素酶报告基因分析显示,mi R-199a-5p调控该位点明显影响了荧光素酶活性,因此证实mi R-199a-5p直接结合HIF-1α的3’UTR并抑制其表达。3.Western Blot检测结果显示,mi R-199a-5p能够通过调节HIF-1α/P-GSK3β/m PTP分子通路上相关蛋白的表达进而影响心肌缺血再灌注损伤。4.免疫共沉淀和免疫化学染色结果显示,敲低mi R-199a-5p能够促进P-GSK3β与线粒体通透性转换孔上ANT的结合,抑制线粒体损伤。小结:1.报告基因实验证实HIF-1α为mi R-199a-5p的靶基因。2.证实mi R-199a-5p能够通过HIF-1α/P-GSK3β/mPTP轴影响H9C2细胞糖氧剥夺复氧复糖损伤。结论:1.mi R-199a-5p在心肌组织和细胞模型缺血再灌注损伤情况下中表达显著增高。2.mi R-199a-5p通过HIF-1α/P-GSK3β/mPTP轴导致心肌细胞的缺血再灌注损伤。