论文部分内容阅读
目的
1探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)相关性胃炎的中西医研究现状。
2探讨Hp感染后机体的病理状态与胃内菌群改变及炎症微环境的相关性，以揭示Hp相关性胃炎脾胃湿热证的生物学内涵。
3探讨连朴饮治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的作用机制。
(1)构建Hp相关性胃炎脾胃湿热证大鼠模型并进行模型评价。
(2)观察连朴饮对模型大鼠胃黏膜凋亡、免疫细胞分化及相关细胞因子表达的影响，证实连朴饮可通过调节免疫细胞分化和相关细胞因子分泌，改善细胞凋亡，发挥黏膜保护作用。
方法
1理论探讨：通过查阅国内外相关文献，梳理和分析Hp相关性胃炎的病理机制，中医病因病机及证候分布，治疗现状。
2临床观察：纳入符合标准的患者42名，分为慢性胃炎Hp感染脾胃湿热证组(Hp+PWSR，n=17)、慢性胃炎非Hp感染脾胃湿热证组(Hp-PWSR，n=11)、慢性胃炎非Hp感染脾胃虚弱证组(Hp-PWXR，n=14)。内镜下观察各组患者胃黏膜相关病理情况。苏木精-伊红(HE)染色观察胃黏膜组织形态学特点。酶联免疫吸附试验(ELISA )检测各组患者血清干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)，肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor-α，TNF-α)，白细胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)，白细胞介素4(Interleukin-4，IL-4)，白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)，白细胞介素8(Interleukin-8，IL-8)，白细胞介素10(Interleukin-10，IL-10 )，白细胞介素12(Interleukin-12 ， IL-12 )，白细胞介素17a(Interleukin-17a，IL-17a)，白细胞介素18(Interleukin-18，IL-18)，转化生长因子-β(Transforminggrowthfactor-β，TGF-β)，白细胞介素21(Interleukin-21，IL-21)，CXC趋化因子配体12(CXC chemokine ligand 12,CXCL12)的表达。免疫组化(IHC)检测胃黏膜组织CD4+T细胞、CD8+T细胞表达。16SrDNA高通量测序检测胃黏膜菌群。
3实验研究：(1)以高糖高脂饮食喂养，56°乙醇灌胃，人工气候箱制造湿热外环境刺激，联合Hp菌液灌胃，构建Hp相关性胃炎脾胃湿热证大鼠模型。观察大鼠饮食、体重、毛色、大小便等一般情况，快速尿素酶试验和吉姆萨染色测定Hp定植情况，结合HE染色观察大鼠胃黏膜组织形态，对模型进行评价。
(2)SPF级健康雄性Wistar大鼠60只，适应性喂养7天后，随机分为空白对照组(n=10)、Hp相关性胃炎脾胃湿热证模型组(n=10)、连朴饮低剂量组(n=10)，连朴饮中剂量组(n=10)，连朴饮高剂量组(n=10)，四联疗法组(n=10)。采用复合因素造模，造模2周后，从各组抽取两只大鼠检验造模是否成功。造模成功后，第3周开始进行药物干预，连朴饮高、中、低剂量组大鼠分别灌胃15，7.5，3g?kg-1，四联疗法组给予大鼠奥美拉唑(2 mg?kg-1)+阿莫西林(100 mg?kg-1)+克拉霉素(50 mg?kg-1)+胶体果胶秘胶囊(35 mg?kg-1)，2次/d，空白对照组、模型组分别给予等体积蒸馏水灌胃，连续给药21天。干预结束后，取大鼠胃黏膜组织和血清。HE染色观察各组大鼠胃黏膜组织形态。免疫印迹法(Western blot)检测胃黏膜含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞癌-2基因相关X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X，Bax)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白表达。IHC检测Bax蛋白表达。流式细胞技术检测胃黏膜中辅助T细胞(T helper，Th)1、Th2、Th17、调节性T细胞(T regulator，Treg)比例。ELISA检测血清中IFN-γ，TNF-α，IL-4，IL-10，IL-17a，TGF-β的表达水平。
结果
1理论探讨：(1)Hp感染后菌群失调、免疫失衡导致胃部疾病的发生。
(2)Hp相关性胃炎的中医证型主要分为脾胃湿热证、脾胃虚弱(寒)证、寒热错杂证，其中脾胃湿热证为常见证型。(3)中西医结合方案治疗Hp相关性胃炎可提高临床疗效。连朴饮作为Hp相关性胃炎脾胃湿热证的治疗方，可通过多途径、多靶点改善临床症状，提高Hp根除率，减少不良反应。
2临床观察：(1)内镜下观察发现Hp+PWSR患者出现胃黏膜充血水肿、红斑(点、片状、条状)、出血点、黏膜粗糙不平、糜烂、粘液增多的比例明显高于Hp-PWXR(P＜0.05)；出现黏膜粗糙不平的比例明显高于Hp-PWSR(P＜0.05)。Hp-PWSR患者出现胃黏膜充血水肿、红斑(点、片状、条状)、糜烂、粘液增多的比例明显高于Hp-PWXR患者(P＜0.05)。(2)HE染色结果显示，Hp+PWSR组患者胃黏膜组织损伤、炎性细胞浸润、炎症活动度最重，其次为Hp-PWSR组。(3)IHC结果显示，Hp+PWSR患者胃黏膜组织CD4+T细胞、CD8+T细胞的表达明显高于Hp-PWXR患者(P＜0.05)。(4)ELISA结果显示，Hp+PWSR患者血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-12、IL-21、IL-17a水平显著高于Hp-PWXR患者(P＜0.05)，IL-4、IL-10水平显著低于Hp-PWXR患者(P＜0.05)。(5)16SrDNA高通量测序结果显示，Hp+PWSR组Richness、ACE、Chao1、Shannon指数均显著低于Hp-PWSR组和Hp-PWXR组(P＜0.05)。?多样性分析及物种构成分析显示各组菌群构成存在差异。功能预测结果显示，Hp感染患者胃黏膜菌群在辅助因子和维生素代谢、脂质代谢、泛醌及其他萜类醌的生物合成、脂肪因子信号、二甲苯退化、矿物吸收、视黄醇新陈代谢等途径较非Hp感染患者减弱(P＜0.05)，在蛋白复制，重组和修复、谷氨酸突触、细胞色素P450、新霉素生物合成、细菌分泌系统、脂肪酸生物合成等途径较非Hp感染患者增强(P＜0.05)。
3实验研究：(1)造模后，模型组大鼠体重增长缓慢，饮食、饮水量减少，大鼠嗜睡，喜身体蜷缩，被毛潮湿，肛门脱垂，反应较为迟钝，目光呆滞，便质粘，气味较臭，快速尿素酶试验和吉姆萨染色结果显示胃黏膜Hp定植率为90%，HE染色显示模型组大鼠胃黏膜组织出现大量炎性细胞浸润和组织损伤。
(2)HE染色结果显示，空白对照组大鼠胃黏膜组织形态结构完整，腺体排列整齐，无炎性细胞浸润。模型组大鼠胃黏膜表面欠光整，腺体排列紊乱，可见较多的炎性细胞浸润，淋巴滤泡形成，中性粒细胞浸润。连朴饮高、中、低剂量组和四联疗法组大鼠胃黏膜的腺体排列，炎性细胞浸润匀有所改善，以高剂量组改善最为明显。WesternBlot结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠胃黏膜组织Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P＜0.05)；与模型组比较，四联疗法组和连朴饮高剂量组大鼠胃黏膜组织Caspase-3、Bax蛋白表达显著降低(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表达显著升高(P＜0.05)，连朴饮低、中剂量组大鼠胃黏膜组织Bcl-2蛋白表达显著升高(P＜0.05)。IHC结果显示，Bax蛋白在细胞胞浆内表达，蛋白表达趋势与WesternBlot一致。流氏细胞技术结果显示，与空白对照组比较，模型组Th1、Th2、Th17、Treg、Th1/Th2、Th17/Treg比例显著上升(P＜0.05)；与模型组比较，四联疗法组、连朴饮高剂量组Th1、Th2、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg细胞比例显著下降(P＜0.05)。ELISA结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-17a水平显著升高(P＜0.05)，IL-4、IL-10、TGF-?水平显著降低(P＜0.05)；与模型组比较，四联疗法组和连朴饮高剂量组大鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-17a水平显著降低(P＜0.05)，IL-4、IL-10、TGF-β水平显著上升(P＜0.05)，连朴饮中剂量组大鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-17a水平显著降低(P＜0.05)，IL-4、IL-10水平显著上升(P＜0.05)，连朴饮低剂量组大鼠血清TNF-α、IL-17a水平显著降低(P＜0.05)，IL-4、IL-10水平显著上升(P＜0.05)。
结论
1脾胃湿热证是Hp相关性胃炎最为常见的中医证型，连朴饮作为治疗方，疗效确切，深入研究连朴饮的作用机制，有助于为Hp相关性胃炎的治疗提供新思路。
2Hp相关性胃炎脾胃湿热证患者胃黏膜病理改变的出现与Hp感染后宿主胃黏膜菌群结构功能改变，机体免疫反应失衡，炎症状态增强，黏膜病理损伤加重有关。
3复合因素造模可成功构建Hp相关性胃炎脾胃湿热证大鼠模型，连朴饮可通过调节免疫细胞分化和相关细胞因子分泌，改善细胞凋亡，发挥对模型大鼠的胃黏膜保护作用。
1探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)相关性胃炎的中西医研究现状。
2探讨Hp感染后机体的病理状态与胃内菌群改变及炎症微环境的相关性，以揭示Hp相关性胃炎脾胃湿热证的生物学内涵。
3探讨连朴饮治疗Hp相关性胃炎脾胃湿热证的作用机制。
(1)构建Hp相关性胃炎脾胃湿热证大鼠模型并进行模型评价。
(2)观察连朴饮对模型大鼠胃黏膜凋亡、免疫细胞分化及相关细胞因子表达的影响，证实连朴饮可通过调节免疫细胞分化和相关细胞因子分泌，改善细胞凋亡，发挥黏膜保护作用。
方法
1理论探讨：通过查阅国内外相关文献，梳理和分析Hp相关性胃炎的病理机制，中医病因病机及证候分布，治疗现状。
2临床观察：纳入符合标准的患者42名，分为慢性胃炎Hp感染脾胃湿热证组(Hp+PWSR，n=17)、慢性胃炎非Hp感染脾胃湿热证组(Hp-PWSR，n=11)、慢性胃炎非Hp感染脾胃虚弱证组(Hp-PWXR，n=14)。内镜下观察各组患者胃黏膜相关病理情况。苏木精-伊红(HE)染色观察胃黏膜组织形态学特点。酶联免疫吸附试验(ELISA )检测各组患者血清干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)，肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor-α，TNF-α)，白细胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)，白细胞介素4(Interleukin-4，IL-4)，白细胞介素6(Interleukin-6，IL-6)，白细胞介素8(Interleukin-8，IL-8)，白细胞介素10(Interleukin-10，IL-10 )，白细胞介素12(Interleukin-12 ， IL-12 )，白细胞介素17a(Interleukin-17a，IL-17a)，白细胞介素18(Interleukin-18，IL-18)，转化生长因子-β(Transforminggrowthfactor-β，TGF-β)，白细胞介素21(Interleukin-21，IL-21)，CXC趋化因子配体12(CXC chemokine ligand 12,CXCL12)的表达。免疫组化(IHC)检测胃黏膜组织CD4+T细胞、CD8+T细胞表达。16SrDNA高通量测序检测胃黏膜菌群。
3实验研究：(1)以高糖高脂饮食喂养，56°乙醇灌胃，人工气候箱制造湿热外环境刺激，联合Hp菌液灌胃，构建Hp相关性胃炎脾胃湿热证大鼠模型。观察大鼠饮食、体重、毛色、大小便等一般情况，快速尿素酶试验和吉姆萨染色测定Hp定植情况，结合HE染色观察大鼠胃黏膜组织形态，对模型进行评价。
(2)SPF级健康雄性Wistar大鼠60只，适应性喂养7天后，随机分为空白对照组(n=10)、Hp相关性胃炎脾胃湿热证模型组(n=10)、连朴饮低剂量组(n=10)，连朴饮中剂量组(n=10)，连朴饮高剂量组(n=10)，四联疗法组(n=10)。采用复合因素造模，造模2周后，从各组抽取两只大鼠检验造模是否成功。造模成功后，第3周开始进行药物干预，连朴饮高、中、低剂量组大鼠分别灌胃15，7.5，3g?kg-1，四联疗法组给予大鼠奥美拉唑(2 mg?kg-1)+阿莫西林(100 mg?kg-1)+克拉霉素(50 mg?kg-1)+胶体果胶秘胶囊(35 mg?kg-1)，2次/d，空白对照组、模型组分别给予等体积蒸馏水灌胃，连续给药21天。干预结束后，取大鼠胃黏膜组织和血清。HE染色观察各组大鼠胃黏膜组织形态。免疫印迹法(Western blot)检测胃黏膜含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞癌-2基因相关X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X，Bax)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白表达。IHC检测Bax蛋白表达。流式细胞技术检测胃黏膜中辅助T细胞(T helper，Th)1、Th2、Th17、调节性T细胞(T regulator，Treg)比例。ELISA检测血清中IFN-γ，TNF-α，IL-4，IL-10，IL-17a，TGF-β的表达水平。
结果
1理论探讨：(1)Hp感染后菌群失调、免疫失衡导致胃部疾病的发生。
(2)Hp相关性胃炎的中医证型主要分为脾胃湿热证、脾胃虚弱(寒)证、寒热错杂证，其中脾胃湿热证为常见证型。(3)中西医结合方案治疗Hp相关性胃炎可提高临床疗效。连朴饮作为Hp相关性胃炎脾胃湿热证的治疗方，可通过多途径、多靶点改善临床症状，提高Hp根除率，减少不良反应。
2临床观察：(1)内镜下观察发现Hp+PWSR患者出现胃黏膜充血水肿、红斑(点、片状、条状)、出血点、黏膜粗糙不平、糜烂、粘液增多的比例明显高于Hp-PWXR(P＜0.05)；出现黏膜粗糙不平的比例明显高于Hp-PWSR(P＜0.05)。Hp-PWSR患者出现胃黏膜充血水肿、红斑(点、片状、条状)、糜烂、粘液增多的比例明显高于Hp-PWXR患者(P＜0.05)。(2)HE染色结果显示，Hp+PWSR组患者胃黏膜组织损伤、炎性细胞浸润、炎症活动度最重，其次为Hp-PWSR组。(3)IHC结果显示，Hp+PWSR患者胃黏膜组织CD4+T细胞、CD8+T细胞的表达明显高于Hp-PWXR患者(P＜0.05)。(4)ELISA结果显示，Hp+PWSR患者血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-12、IL-21、IL-17a水平显著高于Hp-PWXR患者(P＜0.05)，IL-4、IL-10水平显著低于Hp-PWXR患者(P＜0.05)。(5)16SrDNA高通量测序结果显示，Hp+PWSR组Richness、ACE、Chao1、Shannon指数均显著低于Hp-PWSR组和Hp-PWXR组(P＜0.05)。?多样性分析及物种构成分析显示各组菌群构成存在差异。功能预测结果显示，Hp感染患者胃黏膜菌群在辅助因子和维生素代谢、脂质代谢、泛醌及其他萜类醌的生物合成、脂肪因子信号、二甲苯退化、矿物吸收、视黄醇新陈代谢等途径较非Hp感染患者减弱(P＜0.05)，在蛋白复制，重组和修复、谷氨酸突触、细胞色素P450、新霉素生物合成、细菌分泌系统、脂肪酸生物合成等途径较非Hp感染患者增强(P＜0.05)。
3实验研究：(1)造模后，模型组大鼠体重增长缓慢，饮食、饮水量减少，大鼠嗜睡，喜身体蜷缩，被毛潮湿，肛门脱垂，反应较为迟钝，目光呆滞，便质粘，气味较臭，快速尿素酶试验和吉姆萨染色结果显示胃黏膜Hp定植率为90%，HE染色显示模型组大鼠胃黏膜组织出现大量炎性细胞浸润和组织损伤。
(2)HE染色结果显示，空白对照组大鼠胃黏膜组织形态结构完整，腺体排列整齐，无炎性细胞浸润。模型组大鼠胃黏膜表面欠光整，腺体排列紊乱，可见较多的炎性细胞浸润，淋巴滤泡形成，中性粒细胞浸润。连朴饮高、中、低剂量组和四联疗法组大鼠胃黏膜的腺体排列，炎性细胞浸润匀有所改善，以高剂量组改善最为明显。WesternBlot结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠胃黏膜组织Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表达显著降低(P＜0.05)；与模型组比较，四联疗法组和连朴饮高剂量组大鼠胃黏膜组织Caspase-3、Bax蛋白表达显著降低(P＜0.05)，Bcl-2蛋白表达显著升高(P＜0.05)，连朴饮低、中剂量组大鼠胃黏膜组织Bcl-2蛋白表达显著升高(P＜0.05)。IHC结果显示，Bax蛋白在细胞胞浆内表达，蛋白表达趋势与WesternBlot一致。流氏细胞技术结果显示，与空白对照组比较，模型组Th1、Th2、Th17、Treg、Th1/Th2、Th17/Treg比例显著上升(P＜0.05)；与模型组比较，四联疗法组、连朴饮高剂量组Th1、Th2、Th17、Th1/Th2、Th17/Treg细胞比例显著下降(P＜0.05)。ELISA结果显示，与空白对照组比较，模型组大鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-17a水平显著升高(P＜0.05)，IL-4、IL-10、TGF-?水平显著降低(P＜0.05)；与模型组比较，四联疗法组和连朴饮高剂量组大鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-17a水平显著降低(P＜0.05)，IL-4、IL-10、TGF-β水平显著上升(P＜0.05)，连朴饮中剂量组大鼠血清IFN-γ、TNF-α、IL-17a水平显著降低(P＜0.05)，IL-4、IL-10水平显著上升(P＜0.05)，连朴饮低剂量组大鼠血清TNF-α、IL-17a水平显著降低(P＜0.05)，IL-4、IL-10水平显著上升(P＜0.05)。
结论
1脾胃湿热证是Hp相关性胃炎最为常见的中医证型，连朴饮作为治疗方，疗效确切，深入研究连朴饮的作用机制，有助于为Hp相关性胃炎的治疗提供新思路。
2Hp相关性胃炎脾胃湿热证患者胃黏膜病理改变的出现与Hp感染后宿主胃黏膜菌群结构功能改变，机体免疫反应失衡，炎症状态增强，黏膜病理损伤加重有关。
3复合因素造模可成功构建Hp相关性胃炎脾胃湿热证大鼠模型，连朴饮可通过调节免疫细胞分化和相关细胞因子分泌，改善细胞凋亡，发挥对模型大鼠的胃黏膜保护作用。