前言Sirtuins是一类组蛋白去乙酰化酶,与哺乳动物的新陈代谢和低等生物的寿命有关。SIRT1可以使组蛋白去乙酰化,以调节基因的表达和蛋白质的活性。SIRT1可以调节许多生物过程,如代谢,细胞周期,DNA修复,细胞存活和衰老。许多证据证明了SIRT1和Smad家族成员之间的密切关系。在体内和体外,SIRT1与静息和活性Smad2相互作用,SIRT1在特定位置与Smad2相互作用,Smad2乙酰化可增强SIRT1与Smad2之间的相互作用。在小鼠棕色脂肪组织中,SIRT1通过减少Smad3/ATF4来抑制内质网应激诱导的细胞凋亡。SIRT1可以通过TGF-β/Smad4通路阻止内皮-间质转化,从而起到抑制人内皮细胞纤维化的重要作用。Smads家族蛋白,对细胞的增殖、分化和凋亡起着至关重要的作用。Smads是TGF-β家族受体的主要信号传感器。Smad2和Smad3被称为receptor-regulated Smads,直接参与来自TGF-β受体的信号应答。Smad4作为人类已知的Co-Smads,与R-Smads具有伙伴角色。Smad2和Smad3的磷酸化使其自身暴露于核导入序列,并促进其与Smad4的相互作用。然后这个Smad复合体转移到细胞核中,并在其他相关蛋白如TAZ帮助下,与其靶基因结合。TAZ和ys相关蛋白（YAP）作为转录辅助因子在细胞核内调节转录因子的活性。在人类皮肤真皮成纤维细胞,YAP/TAZ复合物的减少通过激活AP-1诱导Smad7来抑制TGF-β/Smad3通路发出信号。此外,已经证明SIRT1可以调控YAP和TAZ。Hippo信号通路下游存在核内YAP乙酰化/去乙酰化周期变化,另外,YAP在癌细胞中受SIRT1介导的去乙酰化调控。有报道提出,在不同细胞中,miR-27a参与TGF-β信号通路,并起到重要作用。例如,在宫颈癌中,荧光素酶报告基因证实,在体内,miR-27a作为一个肿瘤抑制因子,直接靶向调控TGF-βR1来降低TGF-βR1的表达以及TGF-β信号通路的激活。在链脲酶素诱导的糖尿病大鼠中,下调的miR-27a靶向调控PRKAA2来激活TGF-β1和Smad3从而降低逼尿肌的纤维化。在人淋巴内皮细胞中,与结肠癌细胞共培养可诱导miR-27a表达升高,并通过负性调控Smad4来增加淋巴管的形成和迁移。在肺癌中,miR-27a通过靶向调控Smad2和Smad4从而抑制由TGF-β诱导的细胞周期阻滞,促进细胞增殖和侵袭。总之,SIRT1,Smads和miR-27a通过TGF-β途径直接或间接显示出紧密的连接。本研究旨在阐明SIRT1是否通过miR-27a靶向Smads调节人皮肤成纤维细胞的凋亡和周期。它可能为预防衰老提供潜在的药物靶标。材料与方法一、细胞培养原代成纤维细胞是从废弃的包皮组织中提取的,这些组织来自中国医科大学第一医院泌尿外科。该实验符合机构医学伦理和人类研究委员会的道德标准。将这些细胞用含有10%胎牛血清（Hyclone,USA）和1%青霉素-链霉素溶液（BI,Israel）的DMEM培养基（Hyclone,USA）在37℃,5%CO2浓度的培养箱中培养。二、免疫荧光染色将原代成纤维细胞用4%多聚甲醛固定20分钟,用含有0.2%Triton X-100和1%BSA的PBS渗透5分钟,并用1%BSA封闭1小时。然后加入抗波形蛋白（VIM）抗体（1:100稀释,BOSTER,中国）或抗α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（1:100稀释,Abcam,UK）4℃过夜。然后加入FITC标记的山羊抗兔IgG（H+L）（稀释1:50,ZSGB-BIO,中国）或FITC标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）（稀释1:50,ZSGB）-BIO,中国)二抗,室温孵育2小时。将细胞核用4’-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）在黑暗中染色10分钟。然后在荧光显微镜下观察细胞。三、MTT法胰酶消化对数期细胞,终止后离心收集,制成细胞悬液。细胞计数,将细胞悬液调整至所需浓度。每孔加入200ul细胞悬浮液,使每孔细胞数为1000-3000个。次日细胞贴壁后,加入不同浓度药物处理。5%CO2,37℃孵育24h小时,倒置显微镜下观察药物的作用效果。每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4h。4h后将上清去掉,每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡30min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。四、转染SIRT1小干扰RNA,miRNA-27a-5p mimic及miR-432-5p mimicSIRT1小干扰RNA（siRNA）,miRNA-27a-5p mimic及miR-432-5p mimic和正常对照均购自Thermo Fisher Scientific,USA。铺板后24小时,当细胞处于70%的汇合时,根据说明书使用5ul lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen,USA）转染10nM siRNA和10nM miRNA-27a-5p mimic及miR-432-5p mimic。然后进行qRT-PCR和western以确定转染效率。五、qRT-PCR用mi RNeasy mini试剂盒（Qiagen,Germany）从成纤维细胞中提取总RNA。对于mRNA,使用GoScript TM Reverse Transcription System（Promega,Germany）进行cDNA合成,然后根据方案用GoScript TM qPCR Master Mix（Promega,Germany）对cDNA进行实时PCR。对于miRNA,使用TaqMan TM MicroRNA Reverse Transcription Kit（Thermo Scientific,USA）和相应的引物（Thermo Scientific,USA）检测表达水平。PCR扩增通过7900HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems,USA）进行。进行熔解曲线分析以检查每个引物对的特异性。2-△△Ct用于计算相对基因表达。六、Western blot当细胞处于80-90%的汇合时收获成纤维细胞,用PBS洗涤并用含有蛋白酶抑制剂PMSF（Beyotime,中国）和磷酸酶抑制剂（Beyotime,中国）的RIPA（Beyotime,中国）裂解。用BCA蛋白质测定试剂盒（Beyotime,China）测量蛋白质含量。将收集的上清液与5×SDS-PAGE样品上样缓冲液（Beyotime,China）混合,并在100℃下加热5分钟。通过10%SDS-PAGE分离变性蛋白质（20ug）并转移至0.45umPVDF膜,然后用含有5%脱脂牛奶或5%BSA的TBST封闭,封闭后,在4℃下过夜孵育一抗。用TBST洗涤膜三次,每次10分钟,并用HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）（1:1000,Beyotime,中国）或HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）（1:1000,Beyotime,中国）室温下孵育1.5小时。用增强的ECL发光液（Beyotime,中国）显现印迹。七、流式细胞术对于细胞凋亡分析,收集细胞并用5ul FITC Annexin V（BD Bioscience,USA）和10ul PI（BD Bioscience,USA）染色15分钟,根据说明书置于在暗处。对于细胞周期分析,收集细胞,用冷PBS洗涤三次,用1.5ml 75%乙醇在4℃固定过夜。用3ul RNase A（Sigma,USA）在37℃和10ul PI下在冰上染色30分钟,在黑暗中保持30分钟。用BD LSRFortessa仪器（BD Bioscience,USA）测试流式细胞术测定,并且细胞凋亡或细胞周期为分别由BD LSRFortessa软件（BD Bioscience,USA）或ModFit软件（Becton Dickinson,USA）分析。八、miRNA微阵列从3个si-SIRT1细胞和3个正常细胞中提取总RNA,用于通过TaqMan TM Array Human MicroRNA A+B板（Thermo Scientific,USA）筛选差异表达的miRNA,其能够精确定量754个人属种的miRNA。用于数据标准化的三种内源对照（U6,RNA44,RNA48）和一种与人无关的阴性对照也包括在TaqMan TM MicroRNA阵列试剂盒中。按照制造商的说明进行实验。九、靶基因预测八种生物信息学工具,包括miRanda,PicTar,PITA 6.0,RNA22 2.0,TargetScan 7.2,miRDB,mi RWalk 2.0和miRNAMap 1.0,用于预测差异表达的miRNA的潜在靶基因。只有当基因重复超过四次才会被认为是可靠的并且被选择用于随后的实验。通过TargetScan 7.2预测mi RNA与潜在靶基因的结合位置。十、生物信息学分析通过使用基因本体论（GO）富集分析,将差异表达的miRNA的预测靶基因分成三个独立的类别,即生物过程（BP）,细胞组分（CC）和分子功能（MF）。京都基因和基因组百科全书（KEGG）数据库用于评估潜在靶基因存在的通路。此外,通过蛋白调控网络分析系统绘制了潜在靶基因的关联。使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8进行GO富集分析和KEGG分析,并使用STRING 10.5进行PPI分析。使用R 3.5.0,Funrich 3.1 for window和Cytoscape 3.6.1实现结果可视化。十一、荧光素酶报告基因测定将293T细胞（Hanbio Biochemistry,Shanghai,China）在转染前24小时接种在96孔板中。将含有pmiR-REPORT对照载体,Luc-Smad2-wt载体或Luc-Smad2-mu载体和miR-27a-5p/miR-432-5p mimic或正常对照的pGV306荧光素酶报告质粒共转染到293T细胞中,使用0.8mg/ml转染试剂（Hanbio Biochemistry,中国上海）。按照Promega双荧光素酶系统的说明进行荧光素酶测定。十二、统计分析所有分析均使用Statistical Package for Social Sciences（SPSS）软件（Version20.0,Inc.,Chicago,IL,USA）进行。使用配对t检验比较配对组。通过one-way ANOVA（双侧）进行多重比较。p值<0.05被认为表示统计学显着性。结果1、获得人皮肤成纤维细胞并确定SIRT1 siRNAs转染条件成纤维细胞分别在17,24和25岁时从3名受试者获得。免疫荧光染色显示培养的细胞是波形蛋白（+）,DAPI（+）,α-SMA（-）,证明细胞是人皮肤成纤维细胞。将两种不同的SIRT1 siRNA（SIRT1 siRNA 1,SIRT1 siRNA 2）分别转染到细胞中,并通过qPCR和蛋白质印迹测试转染的效率。根据结果,SIRT1 siRNA 2和72h是最佳的SIRT1 siRNA和实验时间用于以下实验。2、SIRT1沉默促进细胞凋亡,使G1期细胞减少,G2期细胞增加与对照组相比,si-SIRT1组成纤维细胞凋亡显着增加（p<0.05）,表明SIRT1的沉默可增加成纤维细胞的凋亡。在si-SIRT1组中G1期分数减少并且G2期分数增加（p<0.05）,但S期分数保持不变。3、通过miRNA芯片和生物信息学分析筛选miR-27a-5p和miR-432-5p通过TaqMan TM Array Human MicroRNA A+B卡,在所有3个配对样品中测试了176种miRNA。在这些miRNA中,显示15种miRNA在si-SIRT1细胞和正常细胞之间差异表达（log2FC<-1或>1且p<0.05）。热图和火山图显示14种miRNA的表达减少,1种miRNA（miR-27a-5p）的表达增加。对7个与对照组相比下降超过3倍的miRNA（miR-362-5p,miR-149-5p,miR-365a-3p,mi R-432-5p,miR-539-5p,miR-204-5p,miR-370-3p）和miR-27a-5p来预测靶基因并进行生物信息学分析。基于结果,我们筛选了miR-27a-5p和mi R-432-5p用于进一步的实验。通过qRT-PCR测定验证,在敲除SIRT1后,mi R-27a-5p增加,miR-432-5p减少。miR-27a-5p/miR-432-5p的预测靶基因的生物信息学分析结果分别显示在图中。GO富集分析显示miR-27a-5p/miR-432-5p的预测靶基因主要富集在细胞核中,充当分子结合和调节的转录。KEGG途径分析显示这些基因主要影响癌症中的途径。4、沉默SIRT1及过表达miR-27a-5p抑制Smad2,Smad3,Smad4,TAZ和COL1的表达蛋白质-蛋白质相互作用网络将Smad2作为这些预测靶基因中的中枢基因。在那些预测miR-27a-5p以及miR-432-5p的靶基因中,发现Smad2参与许多不同的生物过程,其他基因表明其具有重要作用。通过TargetScan 7.2预测miR-27a-5p与Smad2和miR-432-5p与Smad2的组合位置。荧光素酶报告基因检测显示pGV306-Smad2 3’-UTR报告基因的萤火虫-Luc活性被miR-27a-5p mimic明显抑制（p<0.05）,而miR-432-5p mimic则不然（p>0.05）。根据结果,我们推测SIRT1的沉默可以通过增加的miR-27a-5p降低Smad2。因此,我们通过western检测了不同条件下Smad2的蛋白质水平。白藜芦醇（RSV）（10uM,Sigma,USA）用作SIRT1激活剂,SRT 1720（2uM,Selleck,中国）用作SIRT1的选择性激活剂。SIRT1在SIRT1 siRNA作用下明显降低,相反,在SRT 1720或RSV的作用下表达增高。Smad2在SIRT1 siRNA组和miR-27a-5p mimic组表达明显降低（p<0.05）,而在SRT 1720组或RSV组未改变。Western-blot结果显示,与对照组相比,si-SIRT1组或miR-27a-5p mimic组中Smad3,Smad4,TAZ和COL1蛋白的表达均下降。YAP或CTGF没有显着差异。5、沉默SIRT1及过表达miR-27a-5p促进细胞凋亡Western-blot结果显示,si-SIRT1组和miR-27a-5p mimic组中BAX升高,RSV组和SRT1720组降低（p<0.05）。相反,miR-27a-5p mimic组中BCL2降低,RSV组和SRT1720组BCL2升高（p<0.05）。流式细胞仪检测结果显示,si-SIRT1组或miR-27a-5p mimic组中细胞凋亡明显增加（p<0.05）,RSV组或SRT 1720组细胞凋亡明显减少（p<0.05）,与对照相比。细胞周期没有显示出规律性结果。6、白藜芦醇可抑制UVA诱导的p38、JNK、MMP1和MMP3的表达mRNA水平,在6h、12h、48h时,MMP1、MMP3的mRNA表达在UVA组升高,给予白藜芦醇之后,由UVA造成的MMP1、MMP3表达升高受到抑制。6h、12h时,c-fos的mRNA表达变化与MMP1、MMP3相同,即在UVA组升高,给予白藜芦醇之后,由UVA造成表达升高受到抑制。12h时,JNK的表达同样有相同变化。蛋白水平,可见MMP1、MMP3、磷酸化p38及磷酸化JNK在UVA照射后升高,给予白藜芦醇处理后,这种升高程度受到抑制,较UVA组降低。其余时间点未发现规律性变化。7、SIRT1沉默后,UVA诱导的p38/JNK通路成分的表达无明显变化Western结果显示,24h时,白藜芦醇抑制UVA引起的MMP1、MMP3的升高作用,在SIRT1沉默之后,作用依然存在,提示,白藜芦醇起到的抑制作用与SIRT1没有明显关系。8、SIRT1可以通过mi R-27a-5p调节UVA诱导的MMP1/COL1/BCL2表达变化Western结果显示,UVA照射后,MMP1表达增加,COL1及BCL2表达降低。而在UVA+Sirtinol组及UVA+mi R-27a-5p mimic组中,MMP1表达增加,COL1及BCL2表达降低,且变化比单独给予UVA照射明显。在这两组基础上,再给予RSV进行回复,发现MMP1、COL1、BCL2的变化均受到抑制。结论1.SIRT1抑制人真皮成纤维细胞凋亡,减少细胞G1期分布,增加细胞G2期分布,同时调控miR-27a-5p和miR-432-5p表达。2.SIRT1通过miR-27a-5p作用于Smad2抑制人真皮成纤维细胞凋亡。3.SIRT1可以通过miR-27a-5p调节UVA诱导的MMP1/COL1/BCL2表达变化。4.白藜芦醇可以抑制UVA诱导的p38、JNK、MMP1和MMP3的表达,但并不是通过SIRT1发挥的作用。