MUC1黏蛋白是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,广泛地表达于多种组织器官的腺上皮细胞,如胰腺、乳腺、消化道和呼吸道,具有保护和参与细胞间黏附、信号传导、免疫调节等多种生物学功能。MUC1在多种肿瘤组织中异常表达,表现为量的增加和结构改变,其畸形糖基化或糖基化不全,使MUC1暴露出新的蛋白表位或新的糖抗原。研究表明,MUC1异常表达与多种肿瘤的侵袭、转移及预后有关。KL-6 mucin是用KL-6 (Krebs von den Lungen-6)单克隆抗体识别的MUC1的一种,其最初是作为一种肺腺癌肿瘤相关抗原发现的。大量的前期研究发现,血液中KL-6 mucin水平能够敏感地反映肺泡上皮和间质的损伤程度,已成为间质性肺炎如肺纤维化(特发性或胶原血管病相关的)、过敏性肺炎、结节病和放射性肺炎的特异性诊断指标。KL-6抗体识别的是暴露在MUC1分子表面的唾液酸化寡糖部分,故与其他抗体相比,KL-6抗体能够更有效地识别MUC1上的糖抗原表位。我们前期的免疫组织化学染色研究表明,KL-6 mucin在壶腹癌、结直肠癌中的异常表达与这些肿瘤的侵袭转移和预后差等恶性生物学行为密切相关。因此,检测KL-6 mucin在肿瘤细胞中的异常表达,可能对这些肿瘤的诊断、治疗和病情监测具有重要的参考价值。β-连环蛋白(p-catenin)是Wnt/β-catenin信号通路中一个非常重要的分子,其与MUC1关系已有广泛的研究。本课题拟研究KL-6 mucin在胃癌、胰腺癌以及各种肝癌组织中的表达及其临床意义,并通过同时检测β-catenin的表达来研究KL-6 mucin与β-catenin的协同表达的临床意义,通过加入糖基化抑制剂初步探讨KL-6 mucin的表面糖链在肿瘤转移中的作用,并进一步用siRNA干扰技术探讨KL-6 mucin在肿瘤恶性增殖、侵袭、转移中的作用机制。本课题的主要研究内容及取得的成果有以下几个方面：1 KL-6 mucin/β-catenin在胃癌组织中的表达及其临床意义的研究用免疫组织化学染色的方法检测了胃癌组织中KL-6 mucin的表达情况,并分析了KL-6 mucin的亚细胞定位与胃癌的临床特征的关系。同时,我们也检测了这些胃癌组织中β-cateninl的表达情况,并分析了KL-6 mucin/β-catenin的协同表达在胃癌中的临床意义。结果表明,胃癌癌巢及其扩散前沿KL-6 mucin的胞膜和/或胞质的表达定位与胃癌的浸润深度、淋巴管浸润、静脉浸润、淋巴结转移和TNM (Tumor Node Metastasis)分期等显著相关。我们进一步分析了癌巢扩散前沿P-catenin的亚细胞定位及其与KL-6 mucin异常表达的关系。结果表明,胃癌癌巢扩散前沿KL-6 mucin在细胞周围膜和/或胞质的表达定位与β-catenin的胞质和胞核定位密切相关。单因素分析表明,癌巢扩散前沿KL-6 mucin表达定位和β-catenin表达定位都与预后显著相关。多因素分析表明,癌巢扩散前沿P-catenin的胞质和胞核定位是胃癌的一个独立的预后指标。2 KL-6 mucin在胰腺癌中的表达、临床意义及其机制的研究首先用免疫组织化学染色的方法检测了胰腺导管癌、胰腺导管内乳头状瘤和胰岛细胞瘤组织中KL-6 mucin的表达。为了进一步检测KL-6 mucin表面糖链与胰腺癌侵袭转移的关系,我们用O-糖基化抑制剂(GalNAc-O-bn)和N-糖基化抑制剂(衣霉素,tunicamycin)来干扰胰腺癌细胞KL-6 mucin的表达,用Western blotting和细胞免疫化学染色的方法检测了加入GalNAc-O-bn和tunicamycin后KL-6 mucin的表达,并用细胞黏附和侵袭实验检测了KL-6 mucin表达变化后对胰腺癌黏附、侵袭等生物学行为的影响。为进一步检测KL-6 mucin在胰腺癌恶性生物学行为如增殖、侵袭和凋亡等中的作用,我们用siRNA的方法干扰了KL-6 mucin的表达。首先,在siGLO green标记的siRNA的帮助下确定最佳转染条件,并用RT-PCR和Western blotting验证了转染效率。然后用免疫荧光和免疫共沉淀等方法检测了KL-6 mucin沉默后上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)和E-cadherin/β-catenin复合物的表达,以及细胞的侵袭能力的变化。另外,还检测了Wnt信号通路中的主要蛋白β-catenin、细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)和c-myc表达的变化,以及细胞的增殖和凋亡等生物学行为的变化。结果显示,KL-6 mucin在所有的胰腺导管癌组织和恶性程度高的胰腺导管内乳头状瘤组织中均呈现阳性表达,而在无转移的胰腺导管内乳头状瘤组织和胰岛细胞瘤中无表达。这表明,KL-6 mucin的表达与胰腺癌的恶性程度密切相关。糖基化抑制剂,尤其是O-糖基化抑制剂GalNAc-O-bn,可使KL-6 mucin的表达明显降低,细胞的黏附和转移能力也显著降低。可见,KL-6 mucin的表面糖基化程度尤其是O-糖基化程度与肿瘤侵袭转移等密切相关。在所选择的转染条件下KL-6 mucin能够有效地被沉默。KL-6 mucin受到干扰后,E-cadherin和E-cadherin/β-catenin复合物的表达明显增加,细胞的侵袭能力明显降低。胞质中β-catenin的量未发生明显的变化,而胞核中的β-catenin、cyclin D1和c-mycl的表达减少,细胞的增殖能力降低,凋亡率明显升高。可见,KL-6 mucin是通过调节P-catenin的亚细胞定位来影响胰腺癌恶性侵袭、转移等生物学行为的。3 KL-6 mucin在结直肠癌组织和其转移性肝组织中的表达及其临床意义我们用免疫组织化学染色的方法检测了结直肠癌患者组织中KL-6 mucin和β-catenin的表达,并分析了这两分子协同表达的临床意义。另外,还检测了结直肠癌肝转移的患者的转移性肝癌组织和原发性肝细胞癌组织中KL-6 mucin的表达及其临床意义。结果表明,约59.7%(46/77)的结直肠癌患者组织中KL-6 mucin的表达特征为细胞周围膜和／或胞质阳性表达。KL-6 mucin的周围膜和／或胞质阳性表达与肿瘤的侵袭深度、淋巴或静脉侵袭的出现、淋巴结转移和晚期TNM分期有显著关系。所有的正常组织中,结肠上皮细胞膜都有较强的β-catenin阳性表达而细胞核中未发现阳性表达。在这些结直肠癌组织中,约45.5%(35/77)的患者组织中β-catenin在细胞膜持续表达,其余的组织(42/77)β-catenin的膜表达降低。统计分析发现,P-catenin膜表达的降低与静脉侵袭有显著关系。KL-6 mucin的周围膜和／或胞质阳性表达与P-catenin膜表达的降低有显著关系。无KL-6 mucin表达组和β-catenin膜表达组患者的生存率要比KL-6 mucin周围膜和／或胞质阳性表达组和β-catenin膜表达降低组的患者要高。另一方面,同时出现KL-6 mucin周围膜和／或胞质阳性和β-catenin膜表达降低组的患者生存率最低,要显著低于单独出现KL-6 mucin周围膜和/或胞质阳性表达组或β-catenin膜表达降低组的患者。这一结果提示,同时出现KL-6 mucin周围膜和/或胞质阳性表达和β-catenin膜表达降低是结直肠癌患者预后差的一个重要的指标。在所有结直肠癌肝转移患者的转移性肝癌组织中,癌细胞的周围膜和／或胞质中KL-6 mucin都呈阳性染色,而周围的非癌组织和所有的原发性肝细胞癌组织中未发现阳性染色。KL-6 mucin在这些肝转移病灶中保持了其在原发性结直肠癌病灶的染色特征,即周围膜和/或胞质阳性染色。这提示,KL-6 mucin周围膜和/或胞质的阳性表达是原发性结直肠癌向肝转移的一个重要指标。检测KL-6 mucinl的表达特征可用于转移性肝癌和原发性肝癌的鉴别诊断。4 KL-6 mucin在各种肝癌患者中的表达及其诊断意义的评价采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验和免疫组织化学染色的方法检测了肝内胆管细胞癌患者、肝细胞癌患者和转移性肝癌患者血清和组织中KL-6 mucin的表达。为了进一步评价KL-6 mucin作为肝内胆管癌标记物的特异性和敏感性,用免疫组织化学染色的方法检测了更多的肝内胆管癌组织、肝细胞癌组织和混合型肝细胞癌-胆管癌组织中KL-6 mucin、胆管型细胞角蛋白7(CK7)和肝细胞抗原(Hep Par 1)的表达,并比较了它们在肝细胞癌组织与肝内胆管癌组织的鉴别诊断中的价值。血清学分析发现,肝内胆管癌患者的血清KL-6 mucin水平要显著高于健康人、肝细胞癌患者和转移性肝癌患者。转移性肝癌患者的血清KL-6 mucin水平与健康人的血清KL-6 mucin水平之间也发现有显著性差异。免疫组织化学染色结果显示,KL-6 mucin在所有的转移性肝癌和肝内胆管癌组织中都呈阳性表达,而在所有肝细胞癌组织及周围的非癌组织中都未发现KL-6 mucin的阳性表达。这表明,血清中KL-6 mucin水平的升高可能是由其组织中的高表达引起的。CK7在肝内胆管癌组织和肝细胞癌组织中都有不同程度的阳性表达。在混合型肝细胞癌-肝内胆管癌组织中,其肝细胞癌组织区域和胆管癌组织区域也表现为不同程度的CK7阳性表达。因此,CK7不适合作为肝细胞癌组织与肝内胆管癌组织的鉴别诊断指标。Hep Par 1在所有的非癌组织均无表达,而在所有的ICC组织均为阳性表达。Hep Par 1仅在部分肝细胞癌组织(80%)和混合型肝细胞癌-肝内胆管癌组织的肝细胞癌组织区域(67%)呈阳性表达。Hep Par 1仅能将非癌组织和ICC区分开。KL-6 mucin在所有的肝内胆管癌组织中阳性表达,而在肝细胞癌和正常肝组织中均无有表达。在混合型肝细胞癌-肝内胆管癌组织中也发现了相似的特征,即肝内胆管癌组织区域KL-6 mucin阳性表达,而肝细胞癌组织部分无表达。因此,KL-6 mucin是一个能够将肝内胆管癌组织和肝细胞癌组织区分开的有效诊断指标。本研究取得的主要成果和结论：1.胃癌癌巢扩散前沿,KL-6 mucin的异常表达与肿瘤的侵袭、转移和预后等显著相关。癌巢扩散前沿β-catenin的细胞质和核异常表达可能是胃癌的一个独立预后指标。2. KL-6 mucin的阳性表达与胰腺癌的恶性程度密切相关,因此它可能是一个能较好反映胰腺癌恶性生物学行为的标志物。胰腺癌表面KL-6 mucin的糖基化程度尤其是O-糖基化程度与肿瘤侵袭转移等密切相关。KL-6 mucin是通过调节P-catenin的亚细胞定位来影响胰腺癌侵袭、增殖等恶性生物学行为的。3. KL-6 mucin的周围膜和/或胞质阳性表达与P-catenin膜表达的降低有显著关系。同时出现KL-6 mucin周围膜和/或胞质阳性和β-catenin膜表达降低是结直肠癌患者预后差的一个重要指标。4. KL-6 mucin周围膜和/或胞质的阳性表达是原发性结直肠癌向肝转移的一个重要指标。检测KL-6 mucin的表达特征可用于转移性肝癌和原发性肝癌的鉴别诊断。5.肝内胆管癌患者组织和血清中KL-6 mucin水平要显著高于转移性肝癌患者、肝细胞癌患者和健康人。这提示,血清中KL-6 mucin水平是一个能够将肝内胆管癌患者与其他肝癌患者鉴别诊断的有效标志物。因此,KL-6 mucin是一个能够将肝内胆管癌组织和肝细胞癌组织区分开的有效诊断指标。