肿瘤标志物的灵敏检测对癌症的早期预警诊断、监测复发及判断预后均有重要临床意义。现行对于临床液体样品（尿样、血浆或细胞裂解液）中肿瘤标志物的检测,虽能提供肿瘤标志物的平均表达水平,但检测方法以单一类型标志物检测为主。而肿瘤的发生发展过程通常与不同类型的多种标志物的协同作用密切相关,因此,单一类型的肿瘤标志物检测方法容易造成假阳性信号,不利于临床应用。其次,为进一步了解肿瘤标志物在细胞内表达的异质性和动态分布,目前已经开发出多种细胞内肿瘤标志物的原位检测技术。细胞原位成像技术能够“实时在线”提供肿瘤基因类标志物表达水平和动态分布,被视为癌症早期临床基因诊断的新策略。然而,以往基于无机/有机材料构筑的肿瘤标志物成像探针,仍存在生理毒性高、干扰细胞正常活性和高成本荧光标记的问题。核酸分子优异的生物相容性和可编程性可为肿瘤标志物原位成像平台提供新思路。基于以上论述,本论文基于核酸探针、纳米粒子与信号放大策略的结合构筑了一系列多功能生物探针,首先用于临床液体样品中多种肿瘤标志物同时灵敏检测。此外,为降低原位荧光成像的高成本问题,我们开发了免标记的核酸探针用于固定细胞内肿瘤标志物的原位成像分析。在此基础上,最后开发了“拉链锁钥”型递送核酸探针和细胞内自助卸载探针机制,成功实现了活细胞内核酸类肿瘤标志物的灵敏成像检测。主要包括以下三部分:（1）以端粒酶和端粒酶RNA（TR）作为肿瘤标志物模型,结合含脱氧尿苷/生物素分子信标和双向聚合切刻等温放大反应,构建了一种同时免标记检测蛋白和RNA的高灵敏荧光方法。该方法主要依赖脱氧尿苷对聚合切刻等温放大反应的终止作用,实现利用单一底物探针同步进行两种链置换反应,避免了多种核酸探针的设计,降低了实验成本。此外,通过G-四链体与ZnPPIX结合和ssDNA与SG结合的特定免标记荧光反应,可以实现免标记的多重检测,为生物医学研究和临床诊断提供有力的工具。（2）以固定细胞内端粒酶RNA（TR）作为肿瘤标志物模型,结合串联滚环转录反应和荧光Spinach RNA信号转导机制,构建了一种Spinach RNA适体串策略用于细胞内低表达TR原位成像检测。为保证Spinach RNA的二级结构在复杂的细胞环境中稳定存在,利用短链DNA对Spinach RNA适体末端进行封闭保护。结构稳定的Spinach RNA适体串可激活DFHBI荧光团的荧光,增强了体系的信噪比。该方法利用串联的核酸转录反应生成大量的DFHBI荧光团结合位点,提高了体系的荧光产率和灵敏度。此外,利用所构筑的Spinach RNA适体串可以实现不同细胞中TR表达水平的灵敏成像分析,为低丰度肿瘤标志物在原位免标记成像中提供了新思路。（3）以活细胞内端粒酶RNA（TR）作为肿瘤标志物模型,基于“拉链锁钥”设计了一种简便的DNA/RNA纳米花探针（NFs）实现了多核酸探针的可控装载和细胞内自助释放。首先,由核酸滚环转录产生的长链RNA作为“智能拉链”和递送载体,通过DNA-RNA碱基配对交替锁定多个功能化DNA,产生的RNA/DNA杂交链自组装成NFs。NFs内化到细胞后,细胞内的核酸酶RNase H通过切割DNA/RNA杂交链中的RNA作为特异性开启DNA/RNA NFs的“钥匙”,在有限的空间中释放大量的H1和H2促进细胞质中TR的原位HCR扩增分析。通过在相同的NFs中添加DNA-核定位肽成分还可以灵敏地检测到细胞核中的TR。该策略已成功用于测定不同细胞中TR的表达水平,表明该方法具有灵敏检测活细胞内低丰度肿瘤标志物的潜力。