【摘 要】
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目的:肝纤维化是肝脏在各种致病因素的作用下,肝星状细胞（HSC）激活,细胞外基质生成与降解失衡的病理过程。肝纤维化发生的关键环节是HSC的激活。固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）是胆固醇敏感器,在肝脏中通过调节胆固醇代谢来调控肝脏脂质代谢。目前尚无HSC中的SCAP在肝纤维化中的作用的相关研究。本研究旨在探讨小鼠HSC中的SCAP缺失在小鼠肝纤维化中的作用和相关机制。方法:C57BL/6
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.82170586;No.81900406）；
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目的:肝纤维化是肝脏在各种致病因素的作用下,肝星状细胞（HSC）激活,细胞外基质生成与降解失衡的病理过程。肝纤维化发生的关键环节是HSC的激活。固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白（SCAP）是胆固醇敏感器,在肝脏中通过调节胆固醇代谢来调控肝脏脂质代谢。目前尚无HSC中的SCAP在肝纤维化中的作用的相关研究。本研究旨在探讨小鼠HSC中的SCAP缺失在小鼠肝纤维化中的作用和相关机制。方法:C57BL/6J小鼠喂食Paigen饮食（PD）8周、12周、16周,HE染色观察小鼠肝脏形态,油红O观察小鼠肝脏脂质积聚,天狼猩红染色观察胶原沉积。RT-q PCR检测Col-I、Col-IV的m RNA的表达。免疫荧光检测小鼠肝脏中SCAP的表达以及SCAP与高尔基体的共定位,Western blot和RT-q PCR检测小鼠肝脏SCAP的蛋白及m RNA的表达。为了研究HSC中SCAP在肝纤维化中的作用,我们构建了肝星状细胞SCAP特异性敲除小鼠模型。将SCAPloxp/loxp小鼠与Lrat-cre工具鼠繁殖得到Lrat-cre+/+SCAPfl/fl、Lrat-cre+/-SCAPfl/fl和Lrat-cre-/-SCAPfl/fl小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型。选取Lrat-cre-/-SCAPfl/fl小鼠（雄性,n=8）作为对照组（Con）,Lrat-cre+/+SCAPfl/fl或Lrat-cre+/-SCAPfl/fl小鼠（雄性,n=8）作为实验组(SCAP-/-),PD喂食16周。称量小鼠肝重和体重,计算肝脏指数;检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）;苏木精-伊红（HE）染色观察肝脏形态,油红O观察肝脏脂质积聚,天狼猩红染色法评估肝脏纤维化程度;RT-q PCR和Western blot检测小鼠肝组织中TGF-β/Smad的m RNA及蛋白表达。结果:1.C57BL/6J小鼠PD喂食8周、12周、16周,随着喂食时间的增加,小鼠肝脏大体外观显示肝脏逐渐出现脂肪变性。2.随着PD喂食时间增加,小鼠肝脏油红O染色显示脂质积聚逐渐增加,天狼猩红染色显示肝脏胶原沉积逐渐增加。喂食16周小鼠出现明显肝脏纤维化,RT-q PCR结果显示肝纤维化相关基因Col-I、Col-IV的m RNA表达明显上调。3.随着PD喂食时间的增加,RT-q PCR和Western blot检测显示小鼠肝脏中SCAP的m RNA和蛋白表达逐渐增加。肝脏免疫荧光结果显示PD喂食16周时SCAP与高尔基体共定位增加。4.提取小鼠原代HSC,RT-q PCR结果显示SCAP-/-中SCAP m RNA表达显著降低,免疫荧光染色显示SCAP-/-小鼠HSC中SCAP不表达,表明SCAP-/-小鼠模型建立成功。5.PD喂食16周后,与Con组小鼠相比,SCAP-/-组小鼠肝指数无显著差异。血清学检测显示SCAP-/-小鼠血清中TC含量降低,TG、AST和ALT两组无显著差异。小鼠肝脏HE染色以及油红O染色显示两组小鼠肝脏脂肪变性和脂质积聚无明显变化。天狼猩红染色显示SCAP-/-小鼠肝脏纤维化程度明显减轻,同时,RT-q PCR结果显示SCAP-/-小鼠Col-I、Col-IV的m RNA水平明显降低。6.PD喂食16周后,与Con组相比,RT-q PCR结果显示SCAP-/-组小鼠肝脏中Smad2和Smad3的m RNA表达显著降低,Western blot结果显示SCAP-/-组小鼠肝脏中Smad2/3和P-Smad2/3的蛋白表达显著降低。结论:本实验研究结果表明,PD喂养小鼠16周可以成功构建NASH肝纤维化模型。小鼠肝星状细胞中SCAP的缺失可以通过影响TGF-β/Smad通路来延缓小鼠肝纤维化的发生。
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