论文部分内容阅读
背景:牙周炎是发生在牙周支持组织上的炎症性破坏性疾病,这种破坏是慢性的、持续性的且难以逆转,不予干预的后果往往是牙齿的脱落。目前常规的治疗方式是清除菌斑微生物,消除炎症进而终止疾病的发展。但已破坏的牙周组织是难以恢复的,即便一些以再生为目标的手术治疗,如植骨术、引导性组织再生术等也有着种种缺陷,包括适应症严格、理想的牙周组织再生量少、疗效不确定等。随着组织工程及再生医学的发展,一种基于生长因子递送技术的策略给牙周炎治疗提供了新方法。人胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种肠道L细胞分泌的肠促胰素,通过与其特异性受体(GLP-1R)结合发挥生理效应,循证医学证实其对心血管系统、肾脏、中枢神经系统均有保护作用。GLP-1R广泛分布于包括牙周组织在内的全身多个组织,本课题组前期在细胞实验及动物全身给药中发现该受体激动剂具有抑制牙周组织炎症,促进牙槽骨再生的作用,但全身给药存在副作用大、局部有效浓度低及作用时间短等缺点。因此,基于上述策略本研究通过构建一种缓释体系递送GLP-1R激动剂至牙周局部,探究其对大鼠牙周炎的治疗效果及其抗炎机制,而利拉鲁肽(liraglutide,LIRA)是目前临床上最常用的GLP-1R激动剂。目的:通过聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)及透明质酸(hyaluronic acid,HA)对LIRA实现双重包裹,构建一种负载LIRA(LIRA@PLGA/HA)的牙周缓释体系,并探究此体系对大鼠牙周炎的治疗效果及其抗炎机制,为临床治疗牙周炎提供新方法。方法:(1)使用改良乳化溶剂蒸发法制备负载LIRA的PLGA纳米粒。通过扫描电子显微镜(SEM)、动态光衍射(DLS)对纳米粒的形貌表征、粒径分布进行检测;高效液相色谱(HPLC)、圆二色谱(CD)检测PLGA纳米粒的包封率、载药量、药物释放曲线以及所释放LIRA的二级构象稳定性。最后通过纳米粒与HA粉末的共溶,形成一种可注射的凝胶体系,并与牙周膜细胞共培养,通过CCK-8实验验证其是否具有潜在的细胞毒性。(2)结扎法结合高糖黏性饲料喂养建立大鼠上颌第二磨牙的实验性牙周炎模型。建模完成后通过牙周临床指标、HE染色、亚甲蓝染色等对建模效果进行评估。(3)建模成功后,将牙周炎大鼠分为生理盐水(NaCl)阴性对照组、PLGA/HA空白体系组、盐酸米诺环素软膏(PERIO)阳性对照组、LIRA@PLGA/HA牙周缓释体系组。在大鼠上颌第二磨牙牙周袋内注射给药,每周一次,共四次。给药结束后通过检测大鼠的牙周临床指标、酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)检测大鼠血清及龈沟液中炎性因子(IL-1β,IL-18)的表达、HE染色等探究LIRA@PLGA/HA体系对大鼠牙周炎的抗炎作用;通过Masson染色及Micro-CT等探究该体系的骨保护及骨再生作用。通过qRTPCR、免疫组化实验检测牙周组织中细胞焦亡相关因子NLRP3、Caspase-1的表达,初步探讨LIRA@PLGA/HA体系抑制牙周组织炎症的作用机制。结果:(1)通过改良乳化溶剂蒸发法成功合成负载LIRA的PLGA纳米粒,SEM、DLS检测表明纳米粒形态完整,分散良好。该纳米粒具有75%以上的包封率以及3.5%以上的载药率,在8天内可缓释60~70%的药物,且包裹过程中未破坏LIRA的蛋白二级结构,并且合成的LIRA@PLGA/HA体系无潜在的细胞毒性。(2)通过结扎法结合高糖黏性饲料喂养成功建立大鼠牙周炎模型,建模成功的大鼠牙周组织出现了探诊深度增加、牙龈出血、牙齿松动等典型的牙周炎症状。(3)四组牙周炎大鼠给药后,相比于NaCl组PLGA/HA组,PERIO组和LIRA@PLGA/HA组的牙龈出血指数(BI)、探诊深度(PD)以及炎症因子IL-1β,IL-18表达量均显著降低(P<0.05)。相比于PERIO组,LIRA@PLGA/HA组相应指标虽有所降低,但无统计学差异。此外,相比于其余3组,HE染色、Masson染色、Micro-CT三维重建及骨微参数分析结果进一步证实LIRA@PLGA/HA组更好的抑制了大鼠牙周组织炎症、促进了牙槽骨钙化、成熟和再生;qRT-PCR、免疫组化实验结果显示LIRA@PLGA/HA组下调了大鼠牙周组织中NLRP3、Caspase-1 mRNA和蛋白的表达水平。结论:LIRA@PLGA/HA体系具有良好的缓释效果,并且在牙周炎的治疗中具有抗炎、骨保护及骨再生作用,其抑制炎症的机制可能与细胞焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1的表达降低有关。