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牛结核病(bovine tuberculosis)是一种人畜共患的慢性消耗性传染病,病原为牛分枝杆菌(Mycobacterium Bovis)。该病宿主谱很广,主要宿主为牛,但也可通过感染野生动物和人类,因此结核病的控制带来巨大的困难。牛结核病的流行不仅会严重影响到畜牧业的健康持续发展,而且还影响人类的身心健康和人类结核病的防控造成巨大的障碍。近十几年来,我国由于畜牧业的发展,导致了牲畜流动和交易频繁,导致牛结核病疫情呈上升趋势,对畜牧业健康发展的威胁越来越严重,因此奶牛结核病的防控也愈来愈受到重视。但是我国牛结核病的流行状况不清楚,背景不明给我国对牛结核病的防控带来了巨大的障碍。此外,目前临床使用的牛结核检测方法,如皮试、抗体检测、γ干扰素检测等,敏感度和特异性还有待进一步提高,因此对于牛结核的诊断来讲,还缺乏一个准确、快速的检测方法,来为牛结核的控制和根除提供准确的检测结果。因此,本研究从牛结核病的分子流行病学和结核分支杆菌的新型诊断标识的筛选等角度进行了初步探究,主要研究工作如下：1.结核分枝杆菌新型诊断标识的筛选利用NCBI的Nucleotide数据库,获得了结核分枝杆菌H37Rv与牛分枝杆菌以及卡介苗三者基因组之间的差异区域,共129个ORF的基因序列。针对全长基因序列设计引物,扩增出目的基因,连接到载体pET28a上,转化挑选转化子,通过测序验证,最终得到了66个重组质粒,为进一步的功能研究和诊断标识的筛选打下了基础。采用大肠杆菌菌体和裂解上清对本室保存的牛结核阳性血清进行吸附以去掉其中的非特异性抗体。将鉴定正确的66个重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株,再将重组大肠杆菌人工转接在固体培养基上,过夜生长后,通过菌落转印杂交方法,用吸附后的阳性血清对重组菌进行杂交,用化学发光方法进行杂交信号显色。经初步筛选,获得11个能与阳性血清反应的阳性重组菌。这11种蛋白分别是：牛分枝杆菌相对于结核分枝杆菌缺失的差异区的8个ORF,分别是Rv1585C、Rv0222、Rv3120、Rv2657C、Rv3620C、Rv1255C、Rv3428和Rv2647；另外3个ORF位于BCG相对于牛结核分枝杆菌和结核分枝杆菌的差异区中,分别为Rv0310、Rv1772和Rv3404C。对筛选出的11个阳性重组菌分别进行诱导表达,逐一进行可溶性鉴定后,结果表明有8个蛋白为可溶性表达,另外3个为包涵体中。并且对每个蛋白进行Ni离子亲和层析柱纯化,结果成功纯化了7种可溶性表达的重组蛋白。这7种蛋白分别是Rv0222、Rv1255C、Rv2647、Rv2657C、Rv0310、Rv1772、Rv3404C。进一步采用Western blot和ELISA验证重组蛋白与实验室保存的结核阳性血清和阴性血清间的免疫反应,已经完成上述7种蛋白与牛结核阳性血清的反应的初步验证,结果未能发现阳性血清和阴性血清间同蛋白反应的显著差异。2.牛结核病原学流行病学的调查采取了临床皮试阳性样本共147份,其中苏州的牛肺和淋巴组织样本59份,黄冈的阳性牛鼻拭子57份和牛奶样本31份,并对其进行细菌分离培养。对苏州阳性牛的肺和淋巴组织临床检查时,观察不到明显的病变,但从59份阳性组织病料中,分离出来20株分枝杆菌,分离率为33%。这说明了并不是所有的皮试阳性牛均有临床症状和较高的组织带菌量。对于黄冈的阳性牛鼻拭子样本和奶样,没有分离到临床分离株,这说明了鼻拭子和奶样中含菌量较组织样本中低。采取了屠宰场随机样本共568份,其中来自新疆有281份,山西的有189份,牦牛98份,组织样本均为牛肺和淋巴组织,并对其进行细菌的分离培养。结果在新疆的281份组织样本分离出了6株分枝杆菌,分离率为2.1%；在山西的189份组织样本中分离出了3株,分离率为1.6%；对98份牦牛样本未分离出阳性培养物。采用Spoligotyping对分离的阳性培养物进行了基因分型研究。对来自于苏州、新疆、宜昌等地的17株细菌分离培养物,菌体进行热裂解后,对热裂解产物采用Spoligotyping分子分型方法进行基因分型。通过基因分型可以看出牛分枝杆菌的流行具有一定的地域性。