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[目的]miR-29包括miR-29b和miR-29c三个亚型。近来的研究表明,这三种微小RNA (miRNA)均是抑瘤miRNA (TS-miRNA),其低表达是一些颅外恶性肿瘤发生、发展的重要因素。而胶质瘤细胞有无miR-29a、 miR-29c表达异常减少,它们表达异常减少与胶质瘤发生、发展的关系怎样,均尚不清楚。在哺乳动物细胞中,DNA甲基转移酶3A/3B (DNMT3A、 DNMT3B)是重要的DNA甲基转移酶,可通过催化DNA特定区段从头甲基化参与表观遗传学调控,其过表达可引起重要抑瘤基因启动子区甲基化,由此引起的抑瘤基因表达下调可导致肿瘤发生。有线索显示,在颅外恶性肿瘤细胞中miR-29a、miR-29b、miR-29c均可特异性敲低DNMT3A和DNMT3B的表达：但二者在胶质瘤细胞中的调控关系如何,以及miR-29a、miR-29b、miR-29c低表达或缺失对胶质瘤细胞DNMT3A和DNMT3B表达有无影响,尚有待进一步探讨。我们以人胶质瘤组织标本和人非肿瘤对照脑组织标本及U87MG和U251胶质母细胞瘤细胞系为研究对象,通过检测分析miR-29各亚型在不同级别胶质瘤组织中的表达变化及变化趋势,明确在胶质瘤细胞中DNMT3A和DNMT3B是否是miR-29a、miR-29b和miR-29c的靶基因,并确定DNMT3A和DNMT3B mRNA3’ UTR上这三种miRNA的靶序列,观察和探讨在胶质瘤细胞中这三种miRNA对DNMT3A和DNMT3B表达的敲低作用和作用机制,以期阐明由miR-29a、miR-29b和miR-29c表达异常降低引起的miR-29a/b/c-DNMT3A-DNMT3B通路调控紊乱在胶质瘤发生、发展中的作用,并为建立以该通路为核心的胶质瘤基因干预和分子靶向治疗新策略提供客观的参考依据。[方法]①采用组织微阵列及锁定寡核苷酸原位杂交技术,观察60例不同级别组人胶质瘤及10例非肿瘤对照脑组织组的miR-29a、miR-29b、miR-29c表达水平。②以U87MG和U251细胞为研究对象,通过质脂体介导的miR-29a、 miR-29b、miR-29c Mimics和无义对照序列(Scr)转染,建立三种miR-29转染组(miR-29a/b/c转染组)和Scr对照组,同时以未转染的U87MG及U251作为空白对照组(U87/U25组)；利用茎环引物荧光实时定量RT-PCR (Stem-loop qRT-PCR)检测各组三种miR-29各自的表达水平。③采用生物信息学分析预测DNMT3A和DNMT3B是否是三种miR-29的靶基因,确定其mRNA3’UTR含有的miR-29a/b/c靶序列,并用荧光素酶实验予以证实。④用qRT-PCR和Western blot方法检测各组DNMT3A和DNMT3B mRNA和蛋白的表达水平,观察在胶质瘤细胞三种miR-29的Mimics对DNMT3A和DNMT3B表达的调控作用并探讨其分子机制。⑤利用三种miR-29的抑制剂转染U87MG及U251细胞系(miR-29a/b/c-IH组),观察各抑制剂对DNMT3A和DNMT3B mRNA及蛋白表达水平的影响,以进一步验证上述实验结果,并评价三种miR-29表达异常减少对胶质瘤细胞DNMT3A和DNMT3B过表达的影响及其意义。[结果]①原位杂交结果显示,不同级别组胶质瘤的miR-29a、miR-29b、 miR-29c阳性标记指数(LI%)均明显低于非肿瘤对照脑组织组,且三种miR-29的LI%随胶质瘤良恶性级别升高而相应降低,各组之间差异均有统计学意义。②stem-loop qRT-PCR结果证实,三种miR-29转染组miR-29总含量明显高于空白对照组和Scr对照组,差异有统计学意义。③生物信息学预测结果显示,在DNMT3A和DNMT3B mRNA的3’UTR上均存在三种miR-29的靶序列；荧光素酶报道基因分析进一步证实,在胶质瘤细胞中,三种miR-29均可和DNMT3A和DNMT3B mRNA3’ UTR上的特异性靶序列结合,并有效抑制了荧光素酶报道基因表达,而删除DNMT3A和DNMT3B mRNA3’ UTR靶序列的前6位核苷酸后,上述抑制作用消失；说明DNMT3A和DNMT3B mRNA均为三种miR-29的靶mRNA。④qRT-PCR及Western blot的检测结果显示,三种miR-29转染组U87MG和U251细胞DNMT3A和DNMT3B mRNA和蛋白表达水平均明显低于相应空白对照组和Scr对照组,差异有统计学意义。⑤三种miR-29的抑制剂转染组U87MG及U251细胞DNMT3A和DNMT3B mRNA及蛋白的表达水平均高于相应空白对照组和Scr对照组,差异有统计学意义。[结论]①胶质瘤细胞普遍存在三种miR-29表达的异常降低,其miR-29a. miR-29b、miR-29c的表达水平均随肿瘤良恶性级别的升高而降低,与胶质瘤良恶性级别呈显著负相关；它们的表达水平是评价肿瘤良恶性级别和患者预后的重要参考指标。②转染miR-29a、miR-29b、miR-29c Mimics,可有效纠正胶质瘤细胞中三者的低表达状态。③在胶质细胞中DNMT3A和I)NMT3B确系miR-29a、miR-29b、miR-29c的天然靶基因,这三种miRNA均可通过诱导DNMT3A和DNMT3B的mRNA降解特异性敲低其蛋白表达,并发挥有效的抑瘤作用。④miR-29a、miR-29b、miR-29c抑制剂均可明显提高胶质瘤细胞的DNMT3A和DNMT3B表达水平,进一步说明这三种miRNA异常低表达引起的DNMT3A和DNMT3B表达增加是导致胶质瘤发生、发展的重要分子机制。