Beta-Amyloid与线粒体关系及相关因素的研究

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研究背景与目的 阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)是老年人最常见和最重要的一种中枢神经变性疾病,其临床特点是隐匿起病,持续而无缓解的智能减退、言语障碍和行为异常;记忆障碍尤其是近记忆障碍是其早期突出临床特点。目前,随着人类预期寿命的延长,AD发病呈现上升趋势,成为继心脏病、肿瘤和卒中后的第四位死亡原因。 AD的病因及发病机制至今不清,通常认为与遗传和环境因素有关。约90~95%的病人65岁以后呈晚发性及散发起病,称散发性AD(SporadicAlzheimerdisease,SAD)。老龄化是SAD的重要危险因素,大脑的老龄化伴随细胞和分子水平的多种形态和功能变化,包括葡萄糖/能量代谢、自由基、细胞膜、神经递质和激素的变化。 目前越来越多的证据支持AD病程中存在线粒体功能障碍。通过对ADcybrid细胞及AD病人的脑片及APP转基因鼠的研究,均已发现存在线粒体功能的异常。包括线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ、线粒体膜结构、ATP酶、mtDNA。特别是基于对mtDNA突变的研究,甚至有人提出AD为一种线粒体疾病。特别是线粒体基质中Aβ-bingdingalcholdehydrogenase(AβAD)的研究,首次提出了Aβ可能存在与线粒体的直接作用。 因此提示我们针对AD发病的最重要致病因子Aβ与线粒体之间是否存在直接联系,尤其是Aβ能否进入线粒体从而与基质中相关蛋白发生相互作用,以及相关机制与可能的干预方法进行初步探讨。 我们实验大致分为三部分,第一步进行了大鼠侧脑室注射链脲霉素的AD模型的建立,检测了该模型脑内线粒体功能变化,证实该AD模型存在线粒体功能异常;第二部分应用HEK293及SH-SY5Y细胞研究了Aβ与线粒体关系,利用细胞及线粒体水平共聚焦显微镜下线粒体中Aβ免疫荧光检测,以及免疫共沉淀结合westernblot的方法,并进行Tg2576鼠脑神经元细胞线粒体中APP及Aβ沉积的研究,证实线粒体中存在Aβ。第三部分,通过SH-SY5Y细胞系P-glycoprotein的检测,观察Valinomycin、PPARγagonists对细胞及线粒体摄取Aβ的影响及Troglitazone对细胞摄取Aβ及细胞caspase活性的影响,探讨其机制以及可能的药物干预方法。 方法 第一章大鼠侧脑室注射链脲霉素模型脑内线粒体功能的研究 第一节大鼠侧脑室注射链脲霉素模型建立采用雄性Sprague-Dawley(S-D)大鼠,应用立体定向技术双侧侧脑室注射STZ,三天后重复注射,术前至术后21天行外周血糖测定。 第二节大鼠侧脑室注射链脲霉素模型脑内线粒体功能变化21天后,高效液相法检测鼠脑ADP、ATP及AMP浓度。分光光度计检测不同脑叶皮层细胞色素氧化酶(Cyto-Ox)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、Na+-K+-ATP酶、Ca+-ATP酶、Mg2+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。 第二章线粒体对Aβ摄取的研究 第一节细胞摄取试验采用humanneuroblastoma(SH-SY5Y)及humanembroykidney(HEK293)两种细胞系。细胞爬片,分别加入溶于PβS中的Aβ40,溶于10%NH4OH中的Aβ42,分12小时、24小时、36小时三个时间点及0.5μg/ml、1μg/ml及2μg/ml三个浓度梯度行细胞摄取实验,共聚焦显微镜下观察。 第二节线粒体摄取试验密度梯度离心法提取SH-SY5Y、HEK293两种细胞线粒体,分别加入Aβ40及Aβ421μg/ml,分为4℃、37℃、4℃15分钟后转37℃三组,每组又以5分钟为间隔,分为5分钟至90分钟18组,均用蛋白酶K处理,行线粒体摄取实验。共聚焦显微镜下观察。 第三节免疫沉淀检测线粒体中Aβ采用免疫沉淀的方法将粗提的暴露于Aβ42/401μg/ml24小时的SH-SY5Y、HEK293两种细胞的线粒体提纯,共聚焦显微镜下观察Aβ摄取情况,并用westernblot检测线粒体中的Aβ。 第四节Tg2576鼠脑神经元细胞线粒体中APP/Aβ沉积的研究采用24月龄Tg2576小鼠脑切片,免疫组织化学方法检测神经元线粒体中APP/Aβ的沉积。 第三章对线粒体摄取Aβ影响因素的研究及机制的初步探讨 第一节SH-SY5Y细胞系P-glycoprotein的检测免疫细胞化学方法检测SH-SY5Y细胞系P-glycoprotein是否在线粒体分布。第二节Valinomycin对细胞及线粒体摄取Aβ的影响SH-SY5Y、HEK293两种细胞暴露于0.1μM、0.5μM、1μM及2μM的Valinomycin及1μg/mlAβ42/40中,研究valinomycin对细胞摄取Aβ的影响。第三节PPARγagonists对细胞及线粒体摄取Aβ的影响在暴露于1μg/mlAβ42/40的SH-SY5Y、HEK293两种细胞培养液中分别加入2,4-thiazolidinedione(TZD)、troglitazone、pioglitazone,采用0.5μM、1μM、5μM及10μM4个浓度梯度,共聚焦显微镜下观察PPARγagonists对细胞及线粒体摄取Aβ的影响。 第四节Troglitazone对细胞摄取Aβ及细胞caspase活性的影响终浓度分别为1μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM、15μM、20μM、25μM及50μM的troglitazone,加入暴露于1μg/mlAβ42/40的SH-SY5Y、HEK293细胞,westernblot观察摄入两种细胞中的Aβ的变化,流式细胞术检测caspases活性变化。 结论: 1.STZ双侧侧脑室注射大鼠模型存在脑能量代谢及线粒体功能障碍; 2.Aβ可以进入HEK293及SH-SY5Y线粒体,但Aβ40/42与两种细胞的线粒体相互作用的行为表现不同; 3.Tg2576鼠神经细胞线粒体中可以检测到APP/Aβ沉积; 4.Valinomycin可以促进Aβ进入线粒体; 5.SH-SY5Y线粒体膜上没有P-glycoprotein的分布。 6.PPARγAgonists具有保护细胞免予Aβ毒性的作用,降低Aβ引起的caspase活性升高,并且可以减少进入线粒体及细胞的Aβ。
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