背景和目的2020年乳腺癌成为全球第一大癌。乳腺癌是女性肿瘤中最容易发生骨转移的肿瘤,一旦发生骨转移中位生存率仅为3年左右。三阴性乳腺癌占所有乳腺癌的15-20%,具有发病年龄早、进展快、预后差和易复发、易转移等特征,因此针对具有骨转移倾向的乳腺癌患者展开预防、诊断及治疗具有重要临床意义。外泌体携带大量特异性生物信息分子,在细胞与细胞、微环境间进行传递,参与骨转移瘤的发生、发展等多个步骤,有望成为骨转移瘤诊断及治疗的新途径。因此,本研究采用生物信息学技术分析三阴性乳腺癌骨转移的特异性基因,分离提取三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231来源的外泌体（MB231-Exo）,探讨MB231-Exo及其所含的骨转移特异性基因在三阴性乳腺癌骨转移中的作用机制;收集乳腺癌病人血液样本,分析外周血中外泌体内骨转移相关基因表达水平与对照组的差异,为乳腺癌骨转移的预防、早期诊断和精准治疗提供理论依据。方法:1、采用超高速离心法提取乳腺细胞和乳腺癌细胞来源外泌体,采用透射电镜、粒径分析和Western Blot对外泌体的形态、粒径及结构蛋白进行鉴定,应用BCA法测定外泌体蛋白浓度,并采用纳米颗粒跟踪分析和无菌检测明确外泌体在乳腺细胞及乳腺癌细胞中的示踪和无菌情况。2、首先通过划痕实验结合外泌体抑制剂GW4869,明确外泌体MB231-Exo对乳腺癌细胞迁移的作用。随后利用GEO数据库通过生信分析乳腺癌骨转移上调的特异性基因,富集获得发挥主要作用的信号通路,采用信号通路抑制剂,验证其对乳腺癌细胞迁移的作用,同时应用流式细胞术检测L-NAME和GW4869等不同处理组对一氧化氮（NO）水平的影响。通过数字PCR检测内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS/NOS3）和整合素亚单位β2（integrin subunit beta 2,ITGB2）在MB231-Exo中的表达水平,结合外泌体抑制剂GW4869、NOS信号通路抑制剂L-NAME以及ITGB2 si RNA干扰来进一步明确NOS3和ITGB2在MDA-MB-231迁移中的作用;同时通过qPCR和co-IP等技术手段探讨ITGB2上下游基因及其主要作用机制。最后,构建MDA-MB-231-luc乳腺癌骨转移裸鼠模型,使用外泌体MB231-Exo、外泌体抑制剂GW4869、NOS信号通路抑制剂L-NAME进行干预,通过活体成像技术观察小鼠模型中MDA-MB-231细胞转移的实时情况;免疫组化观察各处理组的细胞迁移及增殖情况;通过qPCR方法验证NOS3和ITGB2及上下游基因在肿瘤和骨组织中的表达水平变化。3、首先收集2020年郑州大学附属肿瘤医院乳腺科5例健康人、5例原发三阴性乳腺癌无转移患者和5例三阴性乳腺癌骨转移患者的外周血样本,提取血浆外泌体后通过数字PCR检测乳腺癌骨转移特异性基因NOS3、ITGB2、S100P在以上研究者血浆外泌体中的表达水平;利用TCGA数据库,通过乳腺癌相关的临床数据进行生物信息学分析,重点关注S100P、NOS3和ITGB2在乳腺癌肿瘤组织中的表达情况,并分析其与乳腺癌预后的关系。再回顾分析2016年1月-12月郑州大学附属肿瘤医院乳腺科64例三阴性乳腺癌患者临床资料,提取外周血血浆外泌体,检测外泌体中S100P和ITGB2相对表达水平,结合临床资料建立ROC曲线分析其预测骨转移的敏感性及特异性。结果:1、超高速离心法成功从乳腺癌细胞培养液上清中提取并纯化外泌体,透射电镜观察到乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞MCF-10A来源的外泌体直径在30-150 nm之间,呈茶托样结构的膜性囊泡;MCF-7、MDA-MB-231和MCF-10A外泌体的粒径平均值分别为79.94nm、73.65nm和79.81nm。Western Blot实验验证3种细胞外泌体均表达外泌体结构蛋白TSG101,外泌体示踪实验结果显示MB231-Exo与细胞结合能力较MCF-7-Exo和MCF-10A-Exo强。2、通过体外实验发现MDA-MB-231源外泌体MB231-Exo可促进乳腺癌细胞迁移,外泌体抑制剂GW4869可抑制MB231-Exo的促迁移作用。同时分析GEO数据库获得乳腺癌骨转移特有的显著差异性基因296个,富集分析发现eNOS activation和amebodial-type cell migration信号通路变化显著。NO流式实验结果显示NOS抑制剂L-NAME可降低外泌体产量并可逆转MDA-MB-231的迁移,说明eNOS activation可调控MB231-Exo的促肿瘤转移作用。分析eNOS activation和amebodial-type cell migration通路筛选出与乳腺癌骨转移密切相关的NOS3和ITGB2基因,数字PCR检测二者在MDA-MB-231细胞及外泌体中表达均高于对照组MCF-10A和MCF-7,L-NAME在下调NOS3的同时,也下调了ITGB2的表达,说明ITGB2可能受NOS3的调控。进一步分析发现ITGB2的转录因子RUNX2表达也能被L-NAME所抑制。划痕实验显示siITGB2可抑制MDA-MB-231细胞迁移,说明ITGB2可能是NOS发挥促迁移作用的关键分子。qPCR结果显示NOS3与ITGB2及其转录因子RUNX2、下游分子FAK表达水平呈正相关,L-NAME抑制NOS3后,RUNX2、ITGB2和FAK的表达水平均降低。Co-IP结果显示ITGB2能与FAK直接结合,而后者是调节肿瘤转移的关键分子。以上结果表明NOS可调控MB231-Exo分泌,抑制NOS可以下调RUNX2及靶基因ITGB2的表达,而ITGB2可与FAK蛋白直接结合促进MDA-BM-231迁移。在动物实验中,活体成像和免疫组化结果显示L-NAME和GW4869均能抑制MDA-MB-231细胞增殖及转移,对照组肿瘤细胞转移最快并出现肝转移;qPCR结果证实L-NAME下调NOS3水平,RUNX2及其靶基因ITGB2及肿瘤相关基因FAK在肿瘤和骨组织中的表达也下调。结果还发现S100P在MDA-MB-231中的表达水平高于MCF-7和MCF-10A,在相应的细胞外泌体中也观察到同样的现象,L-NAME对S100P的分泌没有调控作用。3、数字PCR检测显示S100P和ITGB2在乳腺癌骨转移患者血浆外泌体中高表达并且与对照组比较有显著差异,尤其是S100P差异最显著（P＜0.001）,NOS3三组间无明显差异。TCGA数据库分析发现S100P在乳腺癌组织中表达高于癌旁组织,且与预后相关。临床数据表明S100P的相对表达量和组织学分级、病理分期、淋巴结转移、骨转移差异具有统计学意义（P＜0.05）,而和年龄差异无统计学意义;ITGB2的相对表达量和病理分期、淋巴结转移、骨转移差异具有统计学意义（P＜0.05）,而和年龄、组织学分级差异无统计学意义。根据3年内是否发生骨转移分为2组建立ROC曲线,ROC曲线显示ITGB2对乳腺癌骨转移的诊断价值（AUC=0.848,敏感性:81%,特异性:86%）高于S100P（AUC=0.832,敏感性:71.4%,特异性:95.3%）。ITGB2和NOS3联合诊断的AUC值最高（AUC=0.900,敏感性:90.5%,特异性86%）。该结果表明血浆外泌体内ITGB2、S100P的表达量对三阴性乳腺癌患者3年内骨转移的诊断具有较高的敏感性和特异性。结论:1、超速离心法获取的三阴性乳腺癌细胞源外泌体MB231-Exo容易被受体细胞摄取,适用于后续研究。2、高转移潜能的三阴性乳腺癌源外泌体在体内外通过eNOS activation促进乳腺癌移植瘤的生长,NOS抑制剂L-NAME可抑制三阴性乳腺癌细胞外泌体MB231-Exo生成,从而有效抑制其促进乳腺癌生长转移的作用;三阴性乳腺癌细胞源外泌体中的主要作用分子为ITGB2,其信号通路机制可能是NOS通过上调RUNX2转录,从而上调靶基因ITGB2的表达,ITGB2进而与信号蛋白FAK结合,促进乳腺癌细胞侵袭和骨转移。3、S100P在乳腺癌组织中表达高于癌旁组织,且与预后相关,提示S100P是一个有潜在价值的肿瘤标记物。S100P和ITGB2在乳腺癌骨转移患者血浆外泌体中表达上调,血浆外泌体内ITGB2、S100P的表达量对三阴性乳腺癌患者3年内骨转移的诊断具有较高的敏感性和特异性,可用于三阴性乳腺癌骨转移的辅助诊断。