论文部分内容阅读
缺血性脑血管疾病(Ischemic cerebrovascular diseases,ICVD)是全球死亡率和致残率较高的疾病之一。脑缺血/再灌注损伤是ICVD的主要病理过程。脑缺血/再灌注损伤发生后,缺血中心区神经细胞发生坏死,而缺血半暗带神经细胞则以凋亡为主要死亡方式,若药物能够阻止缺血半暗带神经细胞的凋亡,将对脑缺血/再灌注损伤的修复产生积极的意义。研究表明,缺血后神经功能恢复非常有限,但缺血后可见缺血周边区突出芽和突触可塑性,促进轴突出芽和突触发生有助于神经功能恢复,因此,抑制神经细胞凋亡、促进神经突触的可塑性,对脑缺血/再灌注损伤后神经的修复具有重要意义。课题组前期研究证实,天麻具有抗脑缺血/再灌注损伤作用,并采用PC12细胞OGD/R(Oxygen glucose deprivation/reoxygenaion)损伤模型对天麻乙酸乙酯提取部位中分离得到的一组酚性成分的活性进行了筛选,确定了主要的活性成分,鉴于原代皮层神经细胞保持了体内神经细胞结构、功能的某些特点,更能反映机体的生理状态,故本实验在前期研究的基础上,采用大鼠原代皮层神经元复制OGD/R损伤模型,并从神经细胞线粒体凋亡通路和突触可塑性的角度对前期研究中能透过血脑屏障且具有抗脑缺血再灌注损伤活性的天麻酚性成分C、D的神经保护作用进行研究,为天麻活性成分用于临床治疗缺血性脑血管疾病提供理论依据。1.天麻酚性成分C、D对原代皮层神经元正常生长的影响目的:培养大鼠胎鼠原代皮层神经元,鉴定其纯度,天麻酚性成分对原代皮层神经元生长的影响进行考察,以确立后续研究的条件。方法:1.1原代皮层神经元的培养及鉴定:取妊娠19日大鼠的胚胎,分离、纯化并培养原代大鼠皮层神经元,用NSE和MAP-2免疫荧光法鉴定原代大鼠皮层神经元及其纯度。1.2原代皮层神经元培养到第7d时,给予不同浓度的天麻酚性成分c、d,继续培养24h,用mtt法测定神经元的存活率,考察天麻酚性成分c、d对原代皮层神经元正常生长的影响。结果:1.1经nse和map-2免疫荧光法染色,原代皮层神经元的纯度达到90%以上,可用于实验研究。1.2天麻酚性成分c在浓度100μg/ml以下(p>0.05)对神经元的生长无影响,当浓度达到200μg/ml时,细胞存活率明显降低,与正常组相比具有显著差异(p<0.05);天麻酚性成分d在浓度50μg/ml(p>0.05)以下对神经元的生长无影响,当浓度达到100μg/ml时,细胞存活率明显降低,与正常组相比具有显著差异(p<0.05)。结论:原代皮层神经元经nse和map-2鉴定,其纯度达到90%,可以进行实验研究;天麻酚性成分c的浓度在100μg/ml(p>0.05)以下对神经元的生长无影响,天麻酚性成分d在浓度50μg/ml(p>0.05)以下对神经元的生长无影响。2.天麻酚性成分c、d对原代皮层神经元ogd/r损伤模型的保护作用目的:复制大鼠胎鼠原代皮层神经元ogd/r损伤模型,探讨天麻酚性成分c、d对其的保护作用。方法:2.1大鼠胎鼠原代皮层神经元ogd/r伤模型的复制:采用不同浓度的na2s2o4无糖earle’s替换原培养液,置于37℃、5%co2、95%空气及饱和湿度条件的培养箱中进行缺糖缺氧损伤1h、2h、4h,然后再替换为神经元培养基继续培养1h,采用mtt法测定神经元的存活率,确定模型na2s2o4的浓度和缺氧时间。2.2原代皮层神经元培养到第7d时,给予不同浓度的天麻酚性成分c、d进行干预,继续培养24h后,复制大鼠胎鼠原代皮层神经细胞ogd/r损伤模型,采用mtt法测定神经元的存活率。2.3原代皮层神经元培养到第7d时,给予不同浓度的天麻酚性成分c、d进行干预,继续培养24h后,复制大鼠原代皮层神经细胞ogd/r损伤模型,收集细胞上清液,检测no含量和ldh漏出率。裂解细胞,收集细胞裂解液,检测mda含量和sod活性。结果:2.1na2s2o4的浓度为40mmol/l,缺糖缺氧1h,复糖复氧1h的条件下,细胞的存活率在50%~60%之间,模型复制成功。2.2天麻酚性成分c在浓度1μg/ml~12.5μg/ml(p<0.05),成分d在浓度0.05μg/ml~1.6μg/ml(p<0.05)范围内能明显提高ogd/r损伤模型细胞的存活率。2.3天麻酚性成分c(3.125μg/ml~25μg/ml)、d(0.2μg/ml~1.6μg/ml)(p<0.05)均能减少ogd/r模型细胞no的释放,提高细胞内sod的活性及抑制mda生成。天麻酚性成分d在0.8μg/ml~1.6μg/ml浓度范围内,能明显抑制ldh的漏出率,天麻酚性成分c对ldh的漏出率无明显的抑制作用。结论:天麻酚性成分c、d能够减轻ogd/r大鼠胎鼠原代皮层神经元受损,提高细胞的存活率,减少no释放,提高细胞内sod的活性和抑制mda生成,对大鼠胎鼠ogd/r损伤模型具有保护作用。3.天麻酚性成分c、d对大鼠胎鼠原代皮层神经元凋亡相关蛋白表达的影响目的:从神经元线粒体凋亡的角度探讨天麻酚性成分c、d是否具有抗神经细胞凋亡的作用。方法:采用蛋白免疫印迹法(western-blot)检测天麻酚性成分c、d对大鼠原代皮层神经元bax、bcl-2、caspase-3蛋白表达的影响,探讨成分c、d的抗神经细胞凋亡作用。结果:天麻酚性成分c(3.125μg/ml~25μg/ml)、d(0.2μg/ml~1.6μg/ml)(p<0.05)均能下调bax蛋白的表达,上调bcl-2蛋白的表达,下调caspase-3蛋白的表达,天麻酚性成分c(3.125μg/ml~6.25μg/ml)、d(0.2μg/ml~0.8μg/ml)(p<0.05)能使bcl-2/bax的比值升高,与模型组相比差异有显著性意义(p<0.05)。结论:天麻酚性成分c、d可通过下调bax蛋白的表达,上调bcl-2蛋白的表达,最终下调caspase-3蛋白的表达,而对抗神经细胞的凋亡。4.天麻酚性成分C、D对大鼠胎鼠原代皮层神经元突触可塑性的影响目的:探讨天麻酚性成分C、D是否能够促进大鼠胎鼠原代皮层神经元突触的可塑性。方法:培养原代皮层神经元,复制OGD/R损伤模型,显微镜拍照,用imageJ测量突触的长度;用蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测成分C、D对大鼠胎鼠原代皮层神经元GAP-43和SYP的表达。结果:天麻酚性成分C(3.125μg/mL~25μg/m L)、D(0.2μg/m~1.6μg/m L)(P<0.05)可促进突触的生长;成分C(12.5μg/m L)能明显促进GAP-43的表达(P<0.05),对SYP的表达有促进趋势;成分D对GAP-43和SYP的表达均有促进的趋势。结论:天麻酚性成分C、D可能通过促进突触生长相关蛋白GAP-43和SYP的表达而促进突触的生长。