【摘 要】
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背景目前,乳腺癌的发病率已经超过肺癌,成为全球第一大癌症,严重影响患者健康及长期生存。肿瘤复发及耐药往往会导致治疗失败,因此,寻求新的分子靶点来改善化疗药物耐药性具有极大的研究价值及临床效益。本课题组前期通过大规模蛋白质组学及生物信息学分析,筛选出核受体亚族 2,F 组第 6 号成员 NR2F6（Nuclear receptor subfamily 2,group F,member 6）与顺铂化疗
【基金项目】
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国家自然科学基金（31901035）； 广东省自然科学基金（2020A1515010951）；
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背景目前,乳腺癌的发病率已经超过肺癌,成为全球第一大癌症,严重影响患者健康及长期生存。肿瘤复发及耐药往往会导致治疗失败,因此,寻求新的分子靶点来改善化疗药物耐药性具有极大的研究价值及临床效益。本课题组前期通过大规模蛋白质组学及生物信息学分析,筛选出核受体亚族 2,F 组第 6 号成员 NR2F6（Nuclear receptor subfamily 2,group F,member 6）与顺铂化疗敏感性及耐药性之间具有一定相关性,并在乳腺癌细胞系中进行了初步验证。目前关于NR2F6是否能作为改善乳腺癌顺铂治疗敏感性的分子靶点的研究仍然十分有限。故在本研究中,我们旨在探究NR2F6是否对乳腺癌细胞生物学功能有影响并探究靶向NR2F6是否能提高乳腺癌顺铂治疗敏感性及其可能的作用机制。方法1.利用生物信息学探究乳腺癌组织及正常癌旁组织中NR2F6的mRNA表达水平及NR2F6对乳腺癌患者远期生存及预后的影响。通过实时荧光定量PCR技术（qPCR）检测 5 种乳腺癌细胞系（MCF-7,UACC-812,SK-BR-3,BT-474,MDA-MB-231）及正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）中NR2F6的mRNA水平,Western blot检测上述6种细胞中NR2F6的蛋白水平。通过慢病毒过表达载体和NR2F6 RNA干扰质粒分别转染到乳腺癌细胞系（MDA-MB-231,MCF-7）中,并筛选得到稳定高/低表达NR2F6的细胞株及其对照细胞,使用Western blot验证细胞株是否构建成功。通过CCK8增殖实验、克隆形成实验、细胞划痕实验及Transwell实验等一系列表型实验验证NR2F6在乳腺癌中的生物学功能。2.采用CCK8法绘制乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DDP及其亲本细胞MCF-7,NR2F6过表达细胞及其对照细胞,NR2F6敲低细胞及其对照细胞的浓度-生长曲线,确定上述细胞的IC50值及耐药系数,并通过一系列表型实验验证顺铂作用下,NR2F6是否对乳腺癌增殖、侵袭和迁移能力有影响。3.对NR2F6顺铂耐药机制的研究。用RNA-seq和蛋白质组学等方法筛选出耐药基因BCL2A1,采用qPCR及Western blot验证BCL2A1,并验证NR2F6是否能通过BCL2A1导致乳腺癌耐药程度发生变化。结果1.TIMER数据库及ULCAN数据库结果提示:与正常癌旁组织相比,乳腺癌组织中NR2F6的表达量更高,Kaplan Meier Plotter生存分析数据库提示:NR2F6高表达患者预后更差（P＜0.05）。CCK8、克隆形成实验、细胞划痕实验及Transwell实验结果提示:NR2F6过表达的MDA-MB-231细胞中增殖、侵袭及迁移能力更弱（P＜0.05）。2.顺铂能刺激MDA-MB-231细胞中NR2F6的表达,并具有时间依赖性。通过应用Pearson相关分析结果提示,在乳腺癌细胞中,IC50值与NR2F6蛋白的相对表达量之间呈正相关（R2=0.84）。乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DDP及其亲本细胞 MCF-7 的 IC50 值分别为 11.98±0.35 μM,6.65±0.93 μM,P 值＜0.0001。与MCF-7细胞相比,MCF-7/DDP细胞中NR2F6的表达量更低（P＜0.05）。过表达NR2F6及其对照细胞的IC50值分别为12.02±0.65 μM,13±0.44 μM,P值＜0.05。敲低NR2F6及其对照细胞的IC50值分别为23.31±0.92 μ M,17.49±0.70 μ M,P 值＜0.0001。3.细胞划痕实验及Transwell实验结果提示:顺铂刺激作用下,NR2F6过表达的MDA-MB-231细胞中侵袭及迁移能力更弱。细胞周期蛋白cleaved caspase3,cleaved caspase7增加,周期蛋白 P21 waf增加,p-H3,p-weel减少。4.利用蛋白质组学质谱分析及转录组差异基因比对,筛选到抗凋亡基因BCL2A1,双敲低NR2F6与BCL2A1与单敲低NR2F6的IC50值分别为9.98±0.65μ M,12.07±0.70 μ M,P 值＜0.0001。结论1.过表达NR2F6会抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、侵袭和迁移能力。顺铂作用下,过表达NR2F6会抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭和迁移能力。2.NR2F6通过BCL2A1维持乳腺癌顺铂治疗的敏感性。
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