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目的：运用分子对接虚拟筛选技术筛选葛根芩连汤君臣（葛根、黄芩、黄连）三味中药干预改善胰岛素抵抗（InsuLinResistance,IR）的潜在活性物质,并采用体外细胞实验探讨其理论可能有效物质改善胰岛素抵抗的作用及可能作用机制。
方法1.从传统中药数据库TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/）中寻找葛根芩连汤中君臣（葛根、黄芩、黄连）三味中药的相关活性化合物，从PubChem(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)数据库中下载小分子活性成分的3D结构；从TTD（http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）数据库中结合文献挖掘寻找2型糖尿病相关靶点蛋白，从PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)数据库中下载靶标蛋白3D结构；采用AutoDock、MOE、SYBYL三个对接软件分别进行分子对接，分别选取三个对接软件的打分排名前50%的化合物，将结果进行比对，选取均位于三个对接结果排名前50%的作为候选化合物1类，以OB≥20%,DL≥0.18，作为二次筛选条件并结合文献将候选化合物1类进行二次筛选，得到最终的候选化合物2类；将候选化合物2类进行文献挖掘，结合其现报道的药理作用确定最终研究的化合物；
2.采用含（2%FBS）的不同胰岛素浓度（1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、2×10-5、2×10-6、2×10-7、2×10-8、2×10-9mol·L-1）诱导HepG2细胞，建立HepG2细胞体外胰岛素抵抗模型，葡萄糖氧化酶法考察建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型最佳造模浓度、干预时间以及胰岛素抵抗的稳定性；
3.由虚拟筛选得到最终化合物葛根素、黄芩苷，MTT法检测不同浓度葛根素（1、3、10、30、100umol·L-1）、黄芩苷（1、3、10、30、50umol·L-1）对IR-HepG2细胞活性的影响；以罗格列酮为阳性对照，葡萄糖氧化酶法检测不同浓度葛根素、黄芩苷对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响并筛选最佳的成分配伍浓度；
4.采用黄芩苷、葛根素最佳配伍浓度作用于IR-HepG2细胞，比色法检测细胞内肝糖原含量；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测有效成分配伍后对葡萄糖激酶（GCK）、葡萄糖转运蛋白-4（GLUT4）含量的影响；RT-PCR检测法检测其对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B（PTP-1B)、过氧化物酶体增殖体激活受体γ（PPAR-γ）、胰岛素受体2（IRS-2）mRNA含量的影响。
结果1.葛根芩连汤君臣（葛根、黄芩、黄连）三味中药从传统中药数据库TCMSP中共搜索到化合物204种，从TTD数据库中结合文献挖掘共找到有明确晶体结构相关靶点蛋白4个：游离脂肪酸受体1（GPR40）、蛋白酪氨酸磷酸酶-1B（PTP-1B）、11β-羟类固醇脱氢酶（11β-HSD）、过氧化物酶体增殖体激活受体γ（PPAR-γ）；经过分子对接筛选和OB、DL值以及文献挖掘筛选过后筛选得到黄芩苷和葛根素两个化合物；
2.胰岛素对HepG2细胞增殖活性和诱导HepG2建立胰岛素抵抗模型条件筛选实验结果：采用MTT法检测出与空白对照组相比，与空白对照组相比，除1×10-5、1×10-6和2×10-5、2×10-6mol·L-1的胰岛素组在不同的时间点对HepG2细胞产生了增殖作用外（P﹤0.05或P﹤0.01），其它各胰岛素浓度组对HepG2细胞增殖均无明显影响（P﹥0.05）；采用葡萄糖氧化酶法筛选出浓度2×10-9mol·L-1的胰岛素培养HepG2细胞36h可以诱导建立稳定的IR模型，胰岛素抵抗稳定性最长可维持36h；
3.黄芩苷、葛根素对IR-HepG2细胞增殖活性和葡萄糖消耗量的影响实验结果：采用MTT法检测出，不同浓度的黄芩苷和葛根素对HepG2细胞增殖无明显影响（P﹥0.05）；与模型组相比，葛根素各剂量组、黄芩苷各剂量组和阳性对照组（罗格列酮）的葡萄糖消耗量呈现出不同程度的显著性增加（P﹤0.05或P﹤0.01或P﹤0.001），其中浓度为10umol·L-1和30umol·L-1的黄芩苷组、浓度为30umol·L-1和100umol·L-1的葛根素干预组葡萄糖消耗增加最具明显（P﹤0.001）；采用析因设计统计学方法，对黄芩苷10umol·L-1和30umol·L-1、葛根素30umol·L-1和100umol·L-1进行分组配伍，结果表明黄芩苷葛根素配伍对改善IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量均有作用，多重比较结果显示(黄芩苷30umol·L-1+葛根素100umol·L-1)配伍组黄芩苷和葛根素的交互作用最明显（F=16.312,P=0.000,P﹤0.001）；
4.黄芩苷、葛根素最佳配伍对IR-HepG2细胞、GLUT4、GCK和肝糖原含量的影响的实验结果：与空白对照组相比，模型组的GCK含量、GLUT4含量和肝糖原含量以及IRS-2和PPAR-γ的mRNA表达水平均显著性降低（P﹤0.001），PTP-1B的mRNA表达水平显著性升高（P﹤0.001）；与模型组相比，(黄芩苷30umol·L-1+葛根素100umol·L-1)配伍组可以增加IR-HepG2细胞内GCK、肝糖原含量、GLUT4和IRS-2mRNA表达水平（P﹤0.01或P﹤0.05），抑制PTP-1B的mRNA的表达（P﹤0.01），对PPAR-γ的表达水平无明显影响（P﹥0.05）；
结论：1.葛根素和黄芩苷是葛根芩连汤治疗2型糖尿病的有效成分；2.葛根素和黄芩苷配伍具有改善胰岛素抵抗的作用，最佳的配伍剂量是(黄芩苷30umol·L-1+葛根素100umol·L-1)；3.其机制可能是通过抑制PTP-1B表达，上调IRS-2和GLUT4增加IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗量能力和储存能力，从而改善胰岛素抵抗。
方法1.从传统中药数据库TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/）中寻找葛根芩连汤中君臣（葛根、黄芩、黄连）三味中药的相关活性化合物，从PubChem(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)数据库中下载小分子活性成分的3D结构；从TTD（http://bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）数据库中结合文献挖掘寻找2型糖尿病相关靶点蛋白，从PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)数据库中下载靶标蛋白3D结构；采用AutoDock、MOE、SYBYL三个对接软件分别进行分子对接，分别选取三个对接软件的打分排名前50%的化合物，将结果进行比对，选取均位于三个对接结果排名前50%的作为候选化合物1类，以OB≥20%,DL≥0.18，作为二次筛选条件并结合文献将候选化合物1类进行二次筛选，得到最终的候选化合物2类；将候选化合物2类进行文献挖掘，结合其现报道的药理作用确定最终研究的化合物；
2.采用含（2%FBS）的不同胰岛素浓度（1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、2×10-5、2×10-6、2×10-7、2×10-8、2×10-9mol·L-1）诱导HepG2细胞，建立HepG2细胞体外胰岛素抵抗模型，葡萄糖氧化酶法考察建立HepG2细胞胰岛素抵抗模型最佳造模浓度、干预时间以及胰岛素抵抗的稳定性；
3.由虚拟筛选得到最终化合物葛根素、黄芩苷，MTT法检测不同浓度葛根素（1、3、10、30、100umol·L-1）、黄芩苷（1、3、10、30、50umol·L-1）对IR-HepG2细胞活性的影响；以罗格列酮为阳性对照，葡萄糖氧化酶法检测不同浓度葛根素、黄芩苷对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响并筛选最佳的成分配伍浓度；
4.采用黄芩苷、葛根素最佳配伍浓度作用于IR-HepG2细胞，比色法检测细胞内肝糖原含量；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测有效成分配伍后对葡萄糖激酶（GCK）、葡萄糖转运蛋白-4（GLUT4）含量的影响；RT-PCR检测法检测其对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B（PTP-1B)、过氧化物酶体增殖体激活受体γ（PPAR-γ）、胰岛素受体2（IRS-2）mRNA含量的影响。
结果1.葛根芩连汤君臣（葛根、黄芩、黄连）三味中药从传统中药数据库TCMSP中共搜索到化合物204种，从TTD数据库中结合文献挖掘共找到有明确晶体结构相关靶点蛋白4个：游离脂肪酸受体1（GPR40）、蛋白酪氨酸磷酸酶-1B（PTP-1B）、11β-羟类固醇脱氢酶（11β-HSD）、过氧化物酶体增殖体激活受体γ（PPAR-γ）；经过分子对接筛选和OB、DL值以及文献挖掘筛选过后筛选得到黄芩苷和葛根素两个化合物；
2.胰岛素对HepG2细胞增殖活性和诱导HepG2建立胰岛素抵抗模型条件筛选实验结果：采用MTT法检测出与空白对照组相比，与空白对照组相比，除1×10-5、1×10-6和2×10-5、2×10-6mol·L-1的胰岛素组在不同的时间点对HepG2细胞产生了增殖作用外（P﹤0.05或P﹤0.01），其它各胰岛素浓度组对HepG2细胞增殖均无明显影响（P﹥0.05）；采用葡萄糖氧化酶法筛选出浓度2×10-9mol·L-1的胰岛素培养HepG2细胞36h可以诱导建立稳定的IR模型，胰岛素抵抗稳定性最长可维持36h；
3.黄芩苷、葛根素对IR-HepG2细胞增殖活性和葡萄糖消耗量的影响实验结果：采用MTT法检测出，不同浓度的黄芩苷和葛根素对HepG2细胞增殖无明显影响（P﹥0.05）；与模型组相比，葛根素各剂量组、黄芩苷各剂量组和阳性对照组（罗格列酮）的葡萄糖消耗量呈现出不同程度的显著性增加（P﹤0.05或P﹤0.01或P﹤0.001），其中浓度为10umol·L-1和30umol·L-1的黄芩苷组、浓度为30umol·L-1和100umol·L-1的葛根素干预组葡萄糖消耗增加最具明显（P﹤0.001）；采用析因设计统计学方法，对黄芩苷10umol·L-1和30umol·L-1、葛根素30umol·L-1和100umol·L-1进行分组配伍，结果表明黄芩苷葛根素配伍对改善IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量均有作用，多重比较结果显示(黄芩苷30umol·L-1+葛根素100umol·L-1)配伍组黄芩苷和葛根素的交互作用最明显（F=16.312,P=0.000,P﹤0.001）；
4.黄芩苷、葛根素最佳配伍对IR-HepG2细胞、GLUT4、GCK和肝糖原含量的影响的实验结果：与空白对照组相比，模型组的GCK含量、GLUT4含量和肝糖原含量以及IRS-2和PPAR-γ的mRNA表达水平均显著性降低（P﹤0.001），PTP-1B的mRNA表达水平显著性升高（P﹤0.001）；与模型组相比，(黄芩苷30umol·L-1+葛根素100umol·L-1)配伍组可以增加IR-HepG2细胞内GCK、肝糖原含量、GLUT4和IRS-2mRNA表达水平（P﹤0.01或P﹤0.05），抑制PTP-1B的mRNA的表达（P﹤0.01），对PPAR-γ的表达水平无明显影响（P﹥0.05）；
结论：1.葛根素和黄芩苷是葛根芩连汤治疗2型糖尿病的有效成分；2.葛根素和黄芩苷配伍具有改善胰岛素抵抗的作用，最佳的配伍剂量是(黄芩苷30umol·L-1+葛根素100umol·L-1)；3.其机制可能是通过抑制PTP-1B表达，上调IRS-2和GLUT4增加IR-HepG2细胞的葡萄糖消耗量能力和储存能力，从而改善胰岛素抵抗。