【摘 要】
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胶原蛋白是动物体内含量最大的一类蛋白质,分布于心血管、骨骼、皮肤等组织和器官内,具有重要的生理功能。目前主流的胶原蛋白获取手段是将动物,如牛、猪的毛皮和结缔组织通过酸、碱、酶水解的方式分解后获得胶原蛋白肽混合物,这种工艺主要存在免疫原性和动物病毒隐患,因此限制了其在许多领域的应用。使用微生物宿主生产重组胶原蛋白能避免这些问题。本论文截取人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的第908至1137位的氨基酸作为表达蛋
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胶原蛋白是动物体内含量最大的一类蛋白质,分布于心血管、骨骼、皮肤等组织和器官内,具有重要的生理功能。目前主流的胶原蛋白获取手段是将动物,如牛、猪的毛皮和结缔组织通过酸、碱、酶水解的方式分解后获得胶原蛋白肽混合物,这种工艺主要存在免疫原性和动物病毒隐患,因此限制了其在许多领域的应用。使用微生物宿主生产重组胶原蛋白能避免这些问题。本论文截取人源Ⅲ型胶原蛋白α1链的第908至1137位的氨基酸作为表达蛋白,在毕赤酵母中进行重组表达,并对重组表达菌株进行发酵优化和5 L发酵罐小试,探究纯化方法,检测其抗氧化性,探究重组胶原蛋白的结构性能,为胶原蛋白的应用开发提供支持。本论文的主要研究结论如下:（1）胶原蛋白的高拷贝毕赤酵母工程菌株的构建。使用AOX1启动子、酿酒酵母α因子信号肽,构建了胶原蛋白单基因表达载体pPIC9K-COL-S、胶原蛋白二串联重复表达载体pPIC9K-COL-2、胶原蛋白二串联重复四拷贝表达载体pPIC9K-COL-4,并且通过电转化法成功整合至毕赤酵母组氨酸基因位点,得到胶原蛋白单基因表达菌株GS115/pPIC9K-COL-S、胶原蛋白二串联重复表达表达菌株GS115/pPIC9K-COL3-2、胶原蛋白二串联重复四拷贝表达表达菌株GS115/pPIC9K-COL3-4。经甲醇诱导发酵后,在发酵液上清中成功鉴定出重组胶原蛋白单体蛋白和二串联重复蛋白。（2）重组胶原蛋白工程菌株的发酵优化。采用高密度摇瓶发酵和5 L发酵罐小试进行重组胶原蛋白工程菌株的发酵优化。对GS115/pPIC9K-COL3-4菌株进行高密度摇瓶发酵优化,经发酵优化后使二串联胶原蛋白菌株表达的胶原蛋白浓度从SDS-PAGE电泳难以检测的水平,提高到蛋白条带清晰可见的程度。通过对高密度摇瓶工艺中的甲醇诱导浓度和发酵天数进行优化,最终在0.5%甲醇诱导浓度下,诱导时间72 h时,二串联胶原蛋白的产量达到最高,浓度为0.45 mg/m L。对菌株GS115/pPIC9K-COL3-4进行5 L发酵罐发酵小试,发酵时间达到120 h时,胶原蛋白浓度达到最高,产量达到1.98mg/m L。（3）重组胶原蛋白的纯化及性质研究。分别使用硫酸铵分级盐析法和镍柱亲和层析法对二串联重组胶原蛋白进行浓缩和纯化,探究最适的纯化方法。结果表明在硫酸铵浓度为40%时能够纯化出重组胶原蛋白,但杂蛋白浓度过高;使用镍柱亲和层析法纯化的胶原蛋白量为3.66 mg,回收率为29.61%。对其体外抗氧化性能进行研究,重组二串联胶原蛋白在6 mg/m L时的DPPH自由基清除率为51.49%,ABTS自由基清除率为41.24%,具有一定的抗氧化功能。圆二色性分析结果表明重组胶原蛋白结构中49.5%为β折叠、25.7%为无序结构、22.7%为β转角,而α螺旋占比最少（1.7%）。通过扫描电镜分析重组胶原蛋白的结构,可见螺旋卷曲和丝状结构,整体有海绵状特征,具有在食品、医药行业作为填料的潜在应用价值。综上所述,本研究通过多拷贝重组表达策略构建了一株表达量较高的重组胶原蛋白的毕赤酵母工程菌株,通过发酵优化和5 L发酵罐小试提升了其表达量,探究了重组胶原蛋白的纯化方法、抗氧化性及微观结构特征,为重组胶原蛋白的应用开发奠定了一定基础。
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