研究背景阿尔茨海默氏病(Alzheimer disease, AD)是老年人中最常见的神经系统退行性疾病,是最常见的老年痴呆,是60岁以上人群的首要致残因素,给社会和家庭带来严重的精神负担。其临床特点是隐袭起病,逐渐出现记忆力减退、认知功能障碍、行为异常和社交障碍。通常病情呈进行性加重,逐渐丧失独立生活能力,发病后10～20年多因并发症而死亡。AD的病理特征包括：细胞外p淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成的老年斑、细胞内tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结(neurofrillary tangle, NFT)、突触减少和神经元丢失。AD的病因尚不完全清楚,一般认为可能与遗传和环境因素有关。AD主要有两种类型：遗传性和散发性,遗传性AD的发病主要与基因突变有关,目前已经明确的有APP基因、PS1基因、PS2基因、tau蛋白基因及UBQLNl(ubiquilin-1)蛋白基因。而散发性AD的发病机制更复杂,目前明确的是与APOE基因突变有关,还存在多种假说,如蛋白的异常(主要为Aβ蛋白及Tau蛋白)、神经递质的异常消耗、胰岛素抵抗(IR)、氧化应激作用机制、神经炎症假说等。近年来发现,约70%-100%的AD患者脑组织内可见脑血管淀粉样变性(Cerebral amyloid angiopathy, CAA), CAA甚至早于老年斑形成,但其发生机制目前仍不清楚,制约了AD的临床诊断和治疗。在对AD患者脑组织中CAA的分布及认知功能降低的研究中证实CAA与认知损害之间有很大关联性,因此CAA也是AD的主要病理学特征之一。大量流行病学调查结果显示,老龄、动脉硬化、高血压、糖尿病、高胆固醇血症、高同型半胱氨酸等不仅是血管性痴呆(vascular dementia, VaD)的危险因素,也是AD的危险因素,这些危险因素均可损伤脑内血流动力学,使脑血流灌注减少,导致脑组织缺血缺氧,影响脑组织代谢,导致血管内皮细胞功能障碍,神经血管单元生理功能损伤等一系列病理变化。由于AD的特征性神经病理学变化和脑血流动力学变化与脑能量代谢障碍密切相关,因此,越来越多的学者认为,AD应该被归为血管性疾病。因此目前,AD的血管机制被越来越多的研究者提到首要位置。目前,AD发生CAA的确切机制仍不明确,而越来越多的研究者认为CAA很可能是由于脑组织代谢产生的Aβ通过血管周围间隙的清除障碍所致。血管周围间隙(Perivascular spaces, PVS)又称Vichow-Robin间隙(Virchow-Robin spaces, VRS),是神经系统内的正常解剖结构,是包绕在动脉和静脉血管周围的微小组织间隙,VRS将血管与周围的脑组织分离开来,VRS充满组织间液,而不是脑脊液。VRS的生理意义是作为脑组织间液排出的一个主要通路,主要清除脑内代谢产生的过多的溶质、溶液及大分子代谢废物,如可溶性Aβ,从结构和功能上看,认为VRS是中枢神经系统的淋巴通道。脑组织间液可通过脑实质内动脉周围间隙进入蛛网膜下腔内大动脉血管周围间隙,并经硬膜淋巴管流入脑外淋巴系统,主要是颈部淋巴结,由此可见,脑内血管壁是脑血液循环和脑淋巴循环共享的解剖结构,血管壁的病变不仅可影响脑血液循环,同时也会导致脑淋巴循环障碍。正常情况下中枢神经系统内产生的可溶性Aβ可通过受体介导的途径入血、酶清除、细胞吞噬、VRS清除等多种途径及时清除出脑,不会导致Aβ沉积,当Aβ产生增多或清除障碍时会异常聚集成有神经毒性的不溶性纤维,异常聚集后的Aβ纤维无法跨内皮细胞转运,脑淋巴循环成为其最主要的清除途径,Aβ在引流过程中容易在局部沉积,导致CAA,反之,CAA形成后阻塞VRS,导致脑淋巴循环障碍,形成恶性循环；因此,CAA的发病过程中脑淋巴循环障碍可能扮演了非常重要的角色。脑内产生的Aβ主要有Aβ 1-40和Aβ1-42两种,而Aβ由可溶性多肽转变成不可溶淀粉样纤维形式是导致其在脑内沉积的关键。脑内代谢活动产生可溶性Aβ多肽后分泌到细胞外,当可溶性Aβ多肽积累到一定程度后就会自发聚合形成可溶性的寡聚体、原纤维和其他形式的中间体,在特定条件下以多肽链间的β-片状折叠形式聚集形成非溶性淀粉样纤维(Aβ纤维)形式,极易沉积并形成淀粉样斑块。其中Ap1-40更容易沉积在血管壁上,而Aβ1-42纤维是老年斑块的主要成分。研究发现Aβ1-42纤维是形成老年斑块及CAA所必需的,即只有当Aβ1-42首先沉积在血管上才可聚集更多的Ap沉积。Aβ1-42纤维是脑组织内毒性最强的Aβ形式,Aβ1-42纤维沉积形成老年斑块及CAA是导致AD发生的主要原因。星形胶质细胞是中枢神经系统内胶质细胞的主要组成部分,通过与脑内其他细胞的接触和连接,具有营养及支持神经元、调节神经递质释放、能量代谢、信号转导、离子缓冲、血流控制等功能,当中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)受到轻微伤害时,星形胶质细胞可立即活化并修复损伤,对维持中枢神经系统内稳态有非常重要的作用。另外,近年来有研究表明脑内小血管周围星形胶质细胞相邻足突间的裂缝在调节Aβ沉积在血管周围间隙上[2]有非常重要的作用。但对CAA形成过程中血管周围星形细胞的病理变化研究较少。星形胶质细胞在CAA形成中的作用仍不明确,因此探讨AD形成过程中星形细胞的病理变化特点具有重要意义,有助于从另一角度来探明AD的发病机制。本研究采用立体定向双侧海马内注射Aβ1-42纤维,采用三重免疫荧光染色动态观察脑组织CAA的形成和星形胶质细胞的病理变化特点,进一步了解AD形成过程中CAA和星形胶质细胞的病理学变化,以探讨AD治疗及预防的新靶点。实验方法1、实验动物及分组：健康成年SPF级SD雄性大鼠40只,体重250±10g,南方医科大学实验动物中心提供。随机分为模型组和对照组,每组20只,每组根据术后处死动物的时间再分为4个亚组：1w、2w、4w、12w; 1w、2w组各2只,4w、12w组各8只。2、Aβ1-42纤维制备：将Ap1-42多肽粉末溶于灭菌0.01mmol/L 1mLPBS溶液中(1μg/gL),将配好的Ap1-42悬液置于37℃恒温水浴摇床中,连续振荡水浴7天即可老化成Aβ1-42纤维,用于制备AD动物模型。3、AD动物模型制备：模型组大鼠采用立体定向技术向大鼠双侧海马内注射已经制备好的Ap1-42纤维,每侧各5ul,对照组大鼠则采用相同的方法向大鼠双侧海马内注射等量灭菌0.01mmol/L的PBS溶液。4、Morris水迷宫试验：模型组及对照组4w、12w组大鼠在造模后进行Morris水迷宫试验。5、脑血流量的检测：模型组及对照组12w组大鼠在造模时、造模后1w、2w、 3w、4wn 8w、12w时用激光多普勒仪分别测大鼠脑表面的血流量。6、取材：各亚组大鼠分别于术后相应时间点采用主动脉灌注固定,留取脑组织标本,予液氮速冻后置于-80℃低温冰箱保存。7、病理学染色：各组大鼠脑组织分别行连续冰冻切片后,分别进行HE染色、刚果红染色,及标记Ap纤维、α肌动蛋白、GFAP的三重间接免疫荧光染色。8、统计分析：Morris水迷宫测试结果以均数±标准差(x±s)表示,大鼠逃避潜伏期统计方法采用重复测量方差分析,探索平台次数采用单因素方差分析,激光多普勒测量的脑血流量采用独立样本t检验。采用SPSS13.0软件进行统计分析,取P<0.05为显著性差异。结果Morris水迷宫实验：经过4天的学习训练,各亚组大鼠的逃避潜伏期时间均逐渐缩短。模型组12周大鼠每天的逃避潜伏期均较对照组12周延长(P<0.05)；而模型组4周大鼠第一天及第二天的逃避潜伏期较对照组4周的延长(P<0.05),第三天及第四天的逃避潜伏期两组间无明显差异；对比总的逃避潜伏期,模型组4周及12周大鼠的逃避潜伏期比相应的对照组大鼠的显著延长(P<0.001)。对比大鼠探索平台次数的变化,4周及12周模型组大鼠探索平台次数较相应的对照组显著减少(P<0.05)。2、脑血流量结果：模型组大鼠的脑血流量随时间推移可逐渐降低,而对照组大鼠的脑血流量无明显变化,两组大鼠脑血流量在造模时、造模后1w、2w无显著差异(P>0.05),而在造模后3w、4w、8w、12w有显著性差异(P<0.001)。3、HE染色：模型组大鼠脑组织切片可见海马区颗粒细胞及锥体细胞减少,神经元变性,血管周围间隙扩张,小血管壁变性、管腔狭窄。对照组HE染色未见明显病理变化。4、刚果红染色：刚果红染色显示,模型1周组大鼠脑组织未见淀粉样蛋白沉积,模型2周组大鼠脑实质和血管周围间隙可见有少量橘红色淀粉样蛋白沉积,模型4周组可见血管周围间隙淀粉样蛋白沉积较2周组明显增多,周围脑实质内可见大量散在分布的淀粉样蛋白,可见血管周围间隙组织较疏松,模型12周组可见大量橘红色淀粉样蛋白沉积在整个血管壁周围,血管周围间隙明显扩张,管壁增厚,管腔狭窄或闭塞。对照组大鼠脑组织均未见明显淀粉样蛋白沉积。5、免疫荧光染色：脑组织三重免疫荧光染色标记Aβ、α-actin和GFAP后在荧光显微镜下观察可见：模型1周组大鼠海马区小血管周围未见淀粉样蛋白沉积,血管周围可见结构较完整的星形细胞；模型2周组大鼠脑实质及小动脉周围可见少量颗粒状的淀粉样蛋白沉积,沉淀周围的星形细胞结构模糊、紊乱；模型4周组小动脉周围可见Aβ纤维沉积,较2周组沉积明显增多,沉积有Aβ纤维的血管周围可见星形胶质细胞GFAP染色明显增强,星形细胞明显聚集增多,结构紊乱不清；模型12周组可见沉积在小动脉上的Aβ纤维较4周组明显增多,小静脉周围也可发现少量Aβ纤维沉积,血管周围GFAP染色阳性的星形胶质细胞聚集增生更多,结构更紊乱。模型组大鼠脑组织均未见经典的淀粉样斑块形成。对照组脑组织及血管周围内均未见Ap纤维沉积,在血管周围只可见GFAP染色结构较完整的少量星胶质细胞。结论1、本研究采用立体定向大鼠双侧海马内注射Aβ1-42纤维制备AD动物模型,经过Morris水迷宫实验评价大鼠高级认知功能情况,发现模型组大鼠的水迷宫逃避潜伏期时间较相应时间点对照组大鼠的水迷宫逃避潜伏期时间明显延长,HE及刚果红染色结果发现,模型组大鼠脑组织内可见CAA样病理性改变,血管周围间隙扩张,血管周围间隙及血管壁上可见颗粒状的淀粉样物质沉积及其周围星形胶质细胞聚集增生。经上述实验可证实,本研究的阿尔茨海默氏病的动物模型造模成功,可用于进一步的实验研究。2、水迷宫实验结果显示模型组大鼠的学习记忆能力较对照组明显下降,表明模型组大鼠的高级认知功能发生了明显的损害。3、激光多普勒仪测量脑血流结果显示模型组大鼠随着造模时间延长其脑表面的血流量逐渐降低,而对照组大鼠脑血流量无明显变化。4、HE染色可见模型组大鼠脑组织海马区神经细胞变性、血管周围间隙扩张、血管壁增厚及管腔狭窄。5、刚果红染色显示模型组大鼠脑组织血管周围间隙及血管壁上均可见淀粉样蛋白沉积,且随着时间推移,血管壁上沉积的淀粉样蛋白越多,血管周围间隙扩张越明显。6、Aβ、α-actin及GFAP标记的三重免疫荧光染色显示脑组织内的Ap逐渐迁移并沉积在血管壁上,形成CAA,小血管周围星形细胞聚集增多、结构紊乱。Aβ1-42纤维早期发现主要沉积在动脉壁上,后期在静脉壁上也可发现有Aβ1-42纤维沉积,最终导致小血管壁及周围的星形胶质细胞发生病理性改变,出现小血管不同程度的狭窄甚至闭塞,导致脑血管搏动减弱,形成恶性循环,加重CAA的形成。7、本研究明确了淀粉样变性脑血管病变和星形胶质细胞聚集增生、结构损伤可能是早期阿尔茨海默氏病突出的病理学变化。