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硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）作为一种新型气体分子已被证明广泛参与人体各种系统的调节。许多研究表明在血管系统中,H2S可以改善血管内皮细胞的功能和舒张血管。它作为一种血管内皮衍生舒张因子,可以由脑血管内皮产生,对缺血性脑损伤有调节作用。内皮源性H2S可由两种途径产生:胱硫醚-γ-裂解酶（Cystathionine-γ-lyase,CSE）和3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-mercaptopyruvate sulfur transferase,3-MST）。前期有相关研究发现H2S可以激活平滑肌细胞膜上的钙离子激活钾通道(Ca2+-sensitive K+channel,KCa)和大鼠海马神经细胞大电导钙激活钾(BKCa)通道,增大相关电流,引起细胞膜超极化,从而舒张血管。Rho A-Rho激酶（Rho-kinase,ROCK）信号通路作为心脑血管系统研究的潜在靶点,可以调节细胞运动、收缩、增殖、血管平滑肌张力及炎症等细胞功能。内皮源性H2S可以抑制Rho A-ROCK通路,舒张脑血管,抗缺血性脑损伤。蛋白激酶A（PKA）在细胞中有多种调节作用,已被证明可以抑制Rho A活性,同时可以增大BKCa通道的活性,但尚未见Rho A是否对PKA有调节作用的研究。因此我们提出这样的科学假设,即H2S可能通过抑制Rho A增强PKA的活性,从而开放BKCa通道。综上本课题通过全细胞膜片钳和其它相关实验技术,拟探讨Rho A-PKA通路在H2S开放大鼠海马神经元BKCa和保护神经元缺氧性损伤中的作用,并采用接近于生理情况的原代大鼠脑血管内皮细胞来探讨内皮源性H2S对神经元BKCa通道。目的:1.探讨Rho A-PKA通路在H2S供体Na HS增加大鼠海马神经元BKCa通道电流中的作用。2.观察大鼠脑血管内皮源性H2S对神经元BKCa通道电流的增加作用。3.探讨Rho A-PKA通路在Na HS保护海马神经元缺氧性损伤中的作用。方法:1.原代培养24 h内SD大鼠乳鼠海马神经细胞和SD成年大鼠脑血管内皮细胞,采用免疫荧光法进行鉴定。2.采用全细胞膜片钳技术,（1）加入BKCa通道特异性阻断剂伊比利亚毒素（iberiotoxin,IBTX）对大鼠海马神经细胞BKCa通道的电流进行鉴定;（2）加入Na HS(1×10-6mol/L)记录外源性H2S对大鼠海马神经细胞BKCa通道电流的影响;（3）加入Rho A抑制剂CCG-1423、Na HS记录Rho A抑制剂预处理对Na HS增加大鼠海马神经元BKCa通道电流的影响;（4）加入PKA抑制剂H-89、Na HS,记录PKA抑制剂单用及合用Na HS对大鼠海马神经元BKCa通道电流的影响;（5）加入原代脑血管内皮细胞（ECs）、乙酰胆碱（ACh）和内源性H2S合成酶抑制剂DL-炔丙基甘氨酸（DL-propargylglycine,PPG）记录内皮源性H2S合成酶CSE抑制剂PPG对大鼠海马神经元BKCa通道电流的影响;（6）加入ECs、ACh和ASP记录H2S合成酶3-MST抑制剂ASP对大鼠海马神经元BKCa通道电流的影响。3.用Western blot法检测H2S对大鼠海马神经细胞Rho A和PKA蛋白表达的影响。4.原代培养大鼠海马神经细胞,建立H/R模型,分为对照组、模型组、Na HS（50、100、200μmol/L）组、CCG-1423(10-6mol/L)组、CCG-1423+Na HS（200μmol/L）组、H-89（10μmol/L）组、H-89+Na HS（200μmol/L）组一共9组,用CCK-8检测细胞活力,测定乳酸脱氢酶（LDH）和神经特异性烯醇化酶（NSE）活性。5.原代培养大鼠海马神经细胞,建立H/R模型,分为对照组、模型组、Na HS（200μmol/L）组、CCG-1423(10-6mol/L)组、CCG-1423+Na HS（200μmol/L）组一共5组,Elisa试剂盒检测PKA活性。结果:1.免疫荧光法鉴定两种原代细胞,证明所培养的细胞为大鼠海马神经细胞和大鼠脑血管内皮细胞。2.全细胞膜片钳技术结果表明（1）所得外向电流可被BKCa通道特异性阻断剂IBTX明显抑制,证明此电流为BKCa通道电流。（2）加入Na HS(1×10-6mol/L)能明显增加大鼠海马神经细胞BKCa通道电流。（3）RhoA抑制剂CCG-1423单用对BKCa通道电流无明显的影响,其预处理后,Na HS虽仍有一定增加BKCa通道电流作用,但明显有所减弱。（4）与Control组相比,Na HS(1×10-6mol/L)明显增大BKCa通道电流,H-89（10μmol/L）单独使用对60和70m V电压时的BKCa通道电流有所减小,与Na HS单用时的作用相比,Na HS与H-89合用增大BKCa通道电流作用有明显的降低;与Na HS组和Control组电流差值比较,H-89+Na HS组与H-89组的电流差值有明显的减小。（5）单独加入ECs、ACh或PPG,以及ECs和PPG联用均对大鼠海马神经细胞BKCa通道电流无明显影响,但是在ECs的基础上加入ACh,BKCa通道电流有显著增加且PPG能部分抑制其增加效应。（6）单独加入ASP以及ECs和ASP联用,对BKCa通道电流无明显影响,但是在ECs的基础上加入ACh,BKCa通道电流有显著增加而ASP对其增加效应无明显影响。3.与Control组相比,单用外源性H2S（Na HS:100μmol/L）和CCG-1423可以显著抑制Rho A表达。与Control组相比,单用外源性H2S（Na HS:100μmol/L）、CCG-1423都可以增加PKA表达,但CCG-1423预处理后Na HS对PKA表达无明显的影响。4.与Control组相比,Model组细胞活力明显降低,LDH和NSE活性明显升高;给予Na HS（50、100、200μmol/L）发现随着Na HS浓度增加,逐步提高H/R损伤降低的神经细胞活力,逐步减少H/R损伤导致的细胞上清中LDH和NSE指标的增加;单独加入CCG-1423,对H/R损伤导致的细胞活力降低和细胞上清中LDH和NSE活性的增加有抑制作用,但是CCG-1423预处理后加入Na HS（200μmol/L）对H/R损伤导致的细胞活力降低和细胞上清中LDH和NSE活性增加的抑制作用显著地减弱;单独加入H-89对H/R损伤导致的神经细胞活力降低和细胞上清中LDH和NSE指标的增加无明显影响,但可以显著减弱Na HS对H/R损伤导致的细胞活力降低和细胞上清中LDH和NSE指标增加的抑制作用。5.与Control组相比,Model组细胞PKA活性明显降低;与Model组比较,用Na HS、Rho A抑制剂CCG-1423都可以明显地提高H/R损伤降低的PKA活性,但CCG-1423预处理后,Na HS对H/R损伤降低的PKA活性无明显的影响。结论:1.H2S对大鼠海马神经细胞H/R损伤的保护作用与Rho A-PKA通路有关。2.H2S增大大鼠海马神经细胞BKCa通道电流可能通过其抑制Rho A,导致PKA上调有关。3.大鼠脑血管内皮源性CSE产生的H2S可激活海马神经元BKCa通道,增大该通道的电流。