【摘 要】
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[目 的]前期研究发现p62蛋白在骨巨细胞瘤（giant cell tumor of bone,GCTB）组织中高表达,体外下调p62蛋白表达能够抑制GCTB单核基质细胞增殖及侵袭,但相关调控机制不明确,并且,体内下调p62蛋白能否抑制GCTB增殖有待验证。本研究通过构建鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型,观察下调p62蛋白对GCTB单核基质细胞胚内增殖的影响;并明确p62蛋白是否通过调控自噬影响GCTB单
【基金项目】
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国家自然科学基金（81760486）；
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[目 的]前期研究发现p62蛋白在骨巨细胞瘤（giant cell tumor of bone,GCTB）组织中高表达,体外下调p62蛋白表达能够抑制GCTB单核基质细胞增殖及侵袭,但相关调控机制不明确,并且,体内下调p62蛋白能否抑制GCTB增殖有待验证。本研究通过构建鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤模型,观察下调p62蛋白对GCTB单核基质细胞胚内增殖的影响;并明确p62蛋白是否通过调控自噬影响GCTB单核基质细胞的增殖。[方法]1.留取GCTB新鲜组织,进行原代细胞培养,分离单核基质细胞,采用免疫荧光检测组蛋白H3.3 G34W,鉴定分离的细胞确为单核基质细胞,选择稳定传代的单核基质细胞进行后续实验。采用慢病毒质粒转染,分别上调、下调p62基因表达,并通过qRT-PCR及Westerm blot实验验证感染效率,建立不同p62表达的单核基质细胞株亚组。2.通过鸡胚绒毛尿囊膜实验,在鸡胚上种植不同亚组单核基质细胞,比较不同亚组的鸡胚成瘤率及成瘤体积,并行HE染色、免疫荧光检测。3.分别使用氯喹、雷帕霉素处理GCTB单核基质细胞后,使用Western blot检测LC3B、p62蛋白表达。使用雷帕霉素处理不同亚组GCTB单核基质细胞后,采用免疫双荧光检测LC3B、p62蛋白定位情况,采用CCK8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。[结 果]1.第三代单核基质细胞生长活跃且衰老比例低,用于后续实验。稳定转染后,获得不同p62表达的单核基质细胞株亚组。GCTB组:正常的GCTB单核基质细胞;shp62组:p62表达下调的GCTB单核基质细胞;NC组（下调空转组）:shp62阴性对照细胞;mp62组:p62表达上调的GCTB单核基质细胞;NEG组（上调空转组）:mp62阴性对照细胞。2.shp62组种植鸡胚共16枚,全部未成瘤;NC组种植鸡胚共24枚,成瘤4枚,成瘤率为16.67%;mp62组种植鸡胚共26枚,成瘤5枚,成瘤率为19.23%。三组、任两组之间成瘤率差异均无统计学意义（P＞0.05）。NC组鸡胚成瘤体积为6.179±2.315mm3,mp62 组鸡胚成瘤体积为 17.792±7.048 mm3,mp62 组较 NC组成瘤体积有所增加,且差异有统计学意义（P=0.027）。鸡胚移植瘤HE染色显示,mp62组较NC组的细胞数量更多,分布更密集,向周围侵袭的趋势更明显;H3.3 G34W免疫荧光染色显示,mp62组单核基质细胞阳性率为61%,NC组阳性率为32%,差异有统计学意义（P=0.038）。3.使用浓度为10nM的雷帕霉素（RAPA）处理GCTB组细胞24h后,LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平升高（P=0.0291）,p62蛋白表达水平降低（P=0.0026）;使用浓度为20μM的氯喹（CQ）处理GCTB组细胞24h后,LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表达无明显变化（P＞0.05）,p62蛋白表达水平降低（P=0.0015）。使用浓度为1OnMRAPA处理不同亚组GCTB单核基质细胞,GCTB+RAPA组细胞增殖水平较GCTB组降低,两组比较24h时差异无统计学意义（P＞0.05）,48h（P=0.0005）、72h（P=0.0012）差异有统计学意义;shp62+RAPA组细胞增殖水平较NC+RAPA组降低,两组比较24h时差异无统计学意义（P＞0.05）,48h（P=0.0147）、72h（P=0.0069）差异有统计学意义。使用浓度为10μM RAPA处理不同亚组GCTB单核基质细胞48h后,GCTB组单核基质细胞的总凋亡比例为（15.99±0.26）%,GCTB+10μM RAPA组单核基质细胞的总凋亡比例为（20.77±0.36）%,差异有统计学意义（P=0.0004）;NC+1OμMRAPA组单核基质细胞的总凋亡比例为（34.66±0.69）%,shp62+1OμM RAPA组单核基质细胞的总凋亡比例为（45.21±0.06）%,差异有统计学意义（P=0.0001）。[结 论]1.下调p62蛋白表达抑制GCTB单核基质细胞的胚内增殖。2.下调p62蛋白可能通过调控自噬抑制GCTB单核基质细胞增殖,促进细胞凋亡。
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