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先天免疫系统通过模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）识别感染病毒的核酸，这些受体通过不同的衔接蛋白将信号传递给IκB激酶（IκB kinases，IKKs），包括经典IKKα、IKKβ及其必需的调节亚基NEMO以及非经典TANK结合激酶-1（TBK1）和IKKi，用于激活转录因子NF-κB和IRF3/7信号传导途径，以诱导细胞因子、I型干扰素（IFN）和IFN刺激基因（ISGs）的产生，发挥细胞内抗病毒效应。泛素化是调节细胞内蛋白降解和功能修饰的一种关键途径，在调控IFN信号通路中发挥着重要的作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染引起猪呼吸困难、流产、死胎及严重的免疫抑制，严重威胁全球养猪业发展。PRRSV引起免疫抑制的主要原因是不能诱导足量的IFN的表达。通过分析PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)的转录组测序结果，发现E3泛素连接酶锚蛋白重复序列和SOCS蛋白8（Ankyrin repeat and SOCS box containing protein-8，ASB8）在PRRSV感染后显著上调，但对其功能的研究尚无报道。本研究旨在探究ASB8在PRRSV感染中的作用机制和对IFN通路的影响，挖掘ASB8的细胞内互作及修饰蛋白，明确其互作修饰细节，了解ASB8在PRRs通路中的调控作用，揭示PRRSV逃避宿主先天性抗病毒免疫的新机制。主要研究结果如下：
（1）ASB8参与多种病毒感染的先天性免疫应答：RNA病毒（PRRSV，SeV，PRV，EMCV）和DNA病毒（HSV和PCV2）感染后均上调了ASB8的表达。
（2）ASB8对IFN信号通路和PRRSV增殖的影响：荧光素酶报告基因系统检测发现ASB8能够剂量依赖性的抑制SeV诱导的IFNβ，ISRE和NF-κB启动子活性。荧光定量结果表明ASB8显著抑制poly（I：C）、SeV和VSV诱导的IFNβ及下游基因（CCL5和CXCL10）的转录，促使SeV和VSV病毒mRNA表达水平明显上调。此外，ASB8过表达促进PRRSV的增殖，ASB8干扰后可以抑制PRRSV的增殖。免疫共沉淀（Co-IP）和免疫荧光实验证实了ASB8与PRRSV非结构蛋白Nsp1α之间的互作关系。而且当ASB8和Nsp1α共转后，对IFNβ和NF-κB的抑制作用进一步增强。泛素化检测发现ASB8介导Nsp1αK63位的泛素化修饰，这种修饰作用是SOCS结构域依赖性的，而且ASB8能增强Nsp1α蛋白的稳定性。
（3）ASB8与激酶复合物的互作调控：在ASB8互作蛋白质谱分析中发现ASB8与IKKβ，热休克蛋白70和富含亮氨酸重复序列10B（LRRC10B）存在互作。Co-IP和免疫荧光实验进一步确认了ASB8能够与IKKβ的结合，同时发现ASB8也与NEMO存在互作。这种互作导致IKKβ发生K48位泛素化和蛋白酶体降解，从而抑制P65和IκBα的磷酸化和NF-κB的产生。此外，当ASB8与激酶复合物（IKKα/β/NEMO和TBK1/IKKi）共转染细胞时发现ASB8可以被激酶IKKβ，TBK1和IKKi磷酸化。质谱分析和ASB8磷酸化突变体转染实验表明，IKKβ催化ASB831位丝氨酸残基的磷酸化，且ASB8的磷酸化对于NF-κB的抑制作用是至关重要的。进一步的荧光素酶报告基因和Co-IP实验发现ASB8还与激酶TBK1和IKKi存在互作，并催化TBK1和IKKi激酶发生K48位泛素化修饰和降解，使IRF3磷酸化水平下降，进一步抑制IFNβ的产生。
（4）LRRC10B参与ASB8与激酶复合物的互作：RNA病毒（PRRSV，SeV,TGEV）感染能够诱导LRRC10B的表达，而且LRRC10B能显著抑制SeV和VSV感染细胞中NF-κB及IFNβ的产生。此外，LRRC10B参与了ASB8和激酶（IKKβ，TBK1和IKKi）之间的相互作用。
综上，我们的研究发现了PRRSV Nsp1α通过劫持宿主E3泛素连接酶ASB8，促进Nsp1αK63连接的泛素化并增强Nsp1α的稳定性，从而促进了PRRSV增殖。ASB8通过与激酶（IKKβ，TBK1和IKKi）互作并被激酶磷酸化，介导激酶的K48位泛素化降解从而抑制IFN信号通路。LRRC10B参与了ASB8与激酶间的互作及PRRs先天性免疫通路的调控。我们的发现丰富了PRRSV造成免疫抑制的理论认识，也为先天性抗病毒免疫提供了新机制。
（1）ASB8参与多种病毒感染的先天性免疫应答：RNA病毒（PRRSV，SeV，PRV，EMCV）和DNA病毒（HSV和PCV2）感染后均上调了ASB8的表达。
（2）ASB8对IFN信号通路和PRRSV增殖的影响：荧光素酶报告基因系统检测发现ASB8能够剂量依赖性的抑制SeV诱导的IFNβ，ISRE和NF-κB启动子活性。荧光定量结果表明ASB8显著抑制poly（I：C）、SeV和VSV诱导的IFNβ及下游基因（CCL5和CXCL10）的转录，促使SeV和VSV病毒mRNA表达水平明显上调。此外，ASB8过表达促进PRRSV的增殖，ASB8干扰后可以抑制PRRSV的增殖。免疫共沉淀（Co-IP）和免疫荧光实验证实了ASB8与PRRSV非结构蛋白Nsp1α之间的互作关系。而且当ASB8和Nsp1α共转后，对IFNβ和NF-κB的抑制作用进一步增强。泛素化检测发现ASB8介导Nsp1αK63位的泛素化修饰，这种修饰作用是SOCS结构域依赖性的，而且ASB8能增强Nsp1α蛋白的稳定性。
（3）ASB8与激酶复合物的互作调控：在ASB8互作蛋白质谱分析中发现ASB8与IKKβ，热休克蛋白70和富含亮氨酸重复序列10B（LRRC10B）存在互作。Co-IP和免疫荧光实验进一步确认了ASB8能够与IKKβ的结合，同时发现ASB8也与NEMO存在互作。这种互作导致IKKβ发生K48位泛素化和蛋白酶体降解，从而抑制P65和IκBα的磷酸化和NF-κB的产生。此外，当ASB8与激酶复合物（IKKα/β/NEMO和TBK1/IKKi）共转染细胞时发现ASB8可以被激酶IKKβ，TBK1和IKKi磷酸化。质谱分析和ASB8磷酸化突变体转染实验表明，IKKβ催化ASB831位丝氨酸残基的磷酸化，且ASB8的磷酸化对于NF-κB的抑制作用是至关重要的。进一步的荧光素酶报告基因和Co-IP实验发现ASB8还与激酶TBK1和IKKi存在互作，并催化TBK1和IKKi激酶发生K48位泛素化修饰和降解，使IRF3磷酸化水平下降，进一步抑制IFNβ的产生。
（4）LRRC10B参与ASB8与激酶复合物的互作：RNA病毒（PRRSV，SeV,TGEV）感染能够诱导LRRC10B的表达，而且LRRC10B能显著抑制SeV和VSV感染细胞中NF-κB及IFNβ的产生。此外，LRRC10B参与了ASB8和激酶（IKKβ，TBK1和IKKi）之间的相互作用。
综上，我们的研究发现了PRRSV Nsp1α通过劫持宿主E3泛素连接酶ASB8，促进Nsp1αK63连接的泛素化并增强Nsp1α的稳定性，从而促进了PRRSV增殖。ASB8通过与激酶（IKKβ，TBK1和IKKi）互作并被激酶磷酸化，介导激酶的K48位泛素化降解从而抑制IFN信号通路。LRRC10B参与了ASB8与激酶间的互作及PRRs先天性免疫通路的调控。我们的发现丰富了PRRSV造成免疫抑制的理论认识，也为先天性抗病毒免疫提供了新机制。