化学修饰纳米孔传感器是一个新兴领域预计对生物分析和在纳米尺度上的化学作用以及单分子检测基本的理解将有重大影响。目前,固态纳米孔的应用正在成为研究的焦点,与生物纳米孔相比,它们提供更大的灵活性,例如形状、大小和表面性质可控等。新制备的固态纳米孔内壁或者表面是氮化硅基质材料组成,没有与待测分子产生特异性识别的位点,限制了它的应用。如果通过化学表面改性或者修饰特异性的基团,可以极大地扩大分析物的范围,实现无标签、在线实时监测生物分子动态互相作用。这种方法赋予纳米孔新的功能,很大程度上提高了纳米孔的选择性和灵敏性。本课题使用FIB制备了单个氮化硅纳米孔,通过氨基硅烷(3-APTES)激活表面,优化了氨基硅烷修饰氮化硅纳米孔的时间对尺寸的控制,多手段表征了3-APTES有效修饰氮化硅纳米孔。研究了调控溶液pH改变3-APTES功能化纳米孔表面电荷有效克服低表面电荷聚苯乙烯微球的易位以及分析了化学功能化的纳米孔孔壁与聚苯乙烯微球易位在纳米尺度上的相互作用,讨论了偏置电压与阻塞电流和易位持续时间的函数关系。在3-APTES激活纳米孔的基础上,进一步使用化学偶联双功能试剂共价偶联氨基DNA探针和辣根过氧化酶分子,作为靶向识别DNA序列传感器以及过氧化氢传感器,在纳米尺度上研究了互补与非互补序列识别的动力学,讨论了偏置电压与阻塞电流以及易位持续时间的函数关系。基于电压反馈控制首次检测了单个辣根过氧化酶分子,考察了纳米孔检测过氧化氢检测限以及线性范围,探索了实时监测单个酶分子生化反应和酶催化底物的产物的易位,从而使得纳米孔变为一种高特异性、低成本、多用途、可集成化/微阵列化、微型化生物传感与检测平台。本论文的研究主要包含内容如下:1.氨基硅烷功能化氮化硅纳米孔使用FIB成功制备了不同孔径的氮化硅纳米孔,优化了氨基硅烷化的时间,通过调控氨基硅烷化的时间可以有效地调节纳米孔的尺寸,氮化硅纳米孔用3-APTES进行修饰,修饰之后通过不同方法相结合表征有效修饰。首先,使用场发射扫描电镜表征了纳米孔被修饰之前和之后的形状外貌,尺寸的变化,结果显示:硅烷化可以调控纳米孔的尺寸;然后,通过微区元素扫描(EDS)表征了纳米孔附近的元素,经过3-APTES修饰的纳米孔周围氮原子百分比N(at.%)相对于未修饰的纳米孔周围的氮原子百分比增长24.42。此外,一个新的元素C出现在3-APTES修饰的纳米孔上,O(at.%)原子百分比从1.41增长到1.65。为了进一步表征3-APTES成功的固定在纳米孔通道内,测量了修饰前后的Ⅰ-Ⅴ曲线,计算得到修饰后的有效孔径。修饰方法稳定便于操作、重复性好、常规实验室即可完成。可以调控表面性质以及为后续的生物分子固定提供良好的活性基团,来扩大纳米孔对物质分析的范围。2.pH调控3-APTES功能化纳米孔的粒子易位在易位实验之前通过马尔文粒径分析仪评估了聚苯乙烯微球在0.02M KC1 pH 5.4,7.0和10.0的表面电荷和水力粒径,通过测量得出100nm的聚苯乙烯微球zeta电势分别为-14.0 mV,-42.9 mV,-65.7 mV并且不会发生团聚。化学修饰纳米孔之后,考察了修饰后纳米孔检测～100nm聚苯乙烯微球的能力。调控溶液的pH,在酸性条件下,表面带正电(质子化),当带负电的聚苯乙烯微球易位时,通过静电相互吸附;在中性条件下,孔表面电荷呈电中性,易位阻力减小;在碱性条件下,孔表面发生水解而带负电荷,与带负电的聚苯乙烯微球相互排斥因此很难观察到易位信号。当偏置电压低于-600 mV时,观察不到易位信号,结果表明:聚苯乙烯微球穿过化学修饰的纳米孔时需要较高的阈值电压。讨论了电压和电流以及易位时间之间的函数关系,发现阻塞电流与电压成线性增加(-600到-900 mV),易位时间与电压成指数衰减:td～e-v/v0。讨论了修饰后聚苯乙烯微球易位与孔壁之间的相互作用。经过统计,当带负电的聚苯乙烯微球穿过带正电的纳米孔时发现有三种典型易位事件。此外,可以降低聚苯乙烯微球易位速度到毫秒级,甚至到秒级,可以有效的克服聚苯乙烯微球的低表面电荷不能易位的情况,对带负电荷的纳米粒子快速分析。3.DNA探针功能化纳米孔靶向识别特定的序列发展了氮化硅纳米孔功能化的三步修饰方法,在硅烷修饰的基础上,通过手臂分子/双功能试剂化学共价连接在其表面引入一个特异性的DNA探针。通过场发射扫描电镜(FESEM),能量色散X射线能谱(EDS)和电流-电压曲线综合表征纳米孔被成功的功能化。通过固定42-mer寡核苷酸探针分子,研究探针与完全互补序列和非互补序列的特异性识别。讨论了电压与阻塞电流以及易位持续时间的关系,通过统计拟合了电压与特异性互补易位事件的阻塞电流和易位时间关系,结果表明:电压与特异性互补易位事件的阻塞电流呈线性增长,与易位时间成指数衰减的关系;在较小的电压下,解链时间较长,在150mV的电压下的解链时间大约是3.6 mns,随着电压的增加解链时间加快,直到在400 mV的电压下,解链时间平台消失。分析了三种典型的易位事件,发现事件类型Ⅰ是DNA特异性识别的易位典型的基本的易位事件,这种事件主要是低电压下出现较多。该生物传感器表现出良好的选择性和特异性。此方法通过化学共价连接生物探针分子,具有通用性,可以固定各种不同目标生物分子识别未知特定DNA序列。4.辣根过氧化酶功能化氮化硅纳米孔过氧化氢传感器首次对单个辣根过氧化酶分子(HRP)基于电压反馈控制进行检测,分析了HRP在不同pH值和不同盐浓度下的zeta电势和水力半径,结果表明:pH ≤ 4 zeta电势是正值,pH ≥ 5是负值,pH 4.3 ±0.2为HRP的等电点,在pH 6～7不会发生团聚;0.1～1M盐浓度下不容易发生团聚,但是1.5～2M盐浓度会发生团聚。分析并且讨论单个酶分子在纳米尺度上的易位行为(～28nm),结果表明:阻塞电流与电压成正比线性增长,持续时间与电压成指数衰减。考察了 HRP在不同孔径～88 nmO.1MKCl易位行为,峰值通过直方图高斯拟合得到:500,700和900 mV偏置电压条件下的ΔG分别为:0.06357 ± 0.00092 nS,0.06485 ±0.00080 nS,0.06822 ± 0.00047 nS。理论上,ΔG应与偏置电压的高低无关,以上三个ΔG值趋于相等证明了实验结果的可靠。28 nm纳米孔对应Δ G为0.08898± 0.000615 nS;88 nmn 孔对应 ΔG 为 0.11408 ±0.00269 nS。结果表明:相同大小的纳米颗粒在较小的空间内通过时造成的变化相对较大。考察了纳米孔检测过氧化氢线性范围以及检测限,分别为5～15 nM,工作曲线:Y=-183.43197X +3580.72629,相关系数0.98623,检测限达到10 pM。实时监测单个酶分子生化反应和酶催化底物易位进行了探讨,观察到新的易位事件,这些易位事件持续时间和电流幅值不同于单个酶分子的易位事件,在这个纳米孔传感系统内酶催化底物的产物和单个酶分子可以有效地区分开来。这种方法为单分子水平研究基因表达和酶动力学以及小分子定量检测提供一种潜能。