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肺癌基因突变的检测与精准定量在肺癌的诊断及靶向治疗中起重要作用。数字PCR（Digital PCR,dPCR）以其直接绝对定量、高灵敏特异和无需标准曲线及校准品等特点,在背景复杂的样本中鉴定稀有突变及微小丰度差异方面具有无可比拟的优势。目前商业化的dPCR系统存在依赖精密昂贵仪器、检测成本高、芯片工艺复杂等缺点,还未能广泛应用于临床检测。因此,亟需开发一种操作较为简易、费用低廉、结果判定简单的基因突变检测新方法。最近,课题组与重庆大学合作研发了一种低挥发“自分配”的d PCR芯片,该芯片以聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane,PDMS）为材料,具有成本低、制作简单的特点,能很好地完成绝对定量分析的检测目标。但前期研发的芯片仍存在依赖于商用d PCR试剂组分、微腔室数目较少、进样时间较长和油密封不充分等问题。因此,本研究拟构建一个自主经济的PCR扩增体系组分,并结合最近研发的新型十万目六边形微腔芯片（Novel 100,000 Hexagonal Microchamber Chip,NHMC）建立一种用于肺癌基因突变绝对定量的NHMC-dPCR平台,旨在为肺癌患者个性化治疗的用药指导、动态监测和非适用患者的排查提供更加简易、快速、经济的基因突变检测方法。【研究目的】构建可用于基因突变绝对定量分析的简易、经济、快速的微腔式芯片d PCR平台,为临床肿瘤患者基因突变检测提供新方法。【研究方法】1.肺癌EGFR基因突变扩增体系组分的设计和验证（1）根据EGFR G719S野生型和突变型序列设计实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time Quantitative PCR Detecting System,q PCR）引物,并构建以p UC57为载体的含有目的序列的野生型质粒（p UC57-G719S W）和突变型质粒（p UC57-G719S M）。（2）采用锁核酸（Locked Nucleic Acid,LNA）和MGB双添加的Taq Man探针法根据EGFR G719S野生型和突变型序列筛选并合成相应的探针及引物;根据文献及前期实验基础在构建EGFR G719S突变扩增体系组分中添加适量比例的牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）溶液,并分析所构建的野生型和突变型体系在芯片外进行q PCR的特异性、扩增效率、灵敏度及重复性。（3）以p UC57-G719S W和p UC57-G719S M为模板进行q PCR反应,优化其最佳参数,如退火温度、引物及探针的浓度。2.NHMC-d PCR平台的建立及在肺癌基因突变检测中的初步应用（1）结合前期芯片研究基础设计NHMC的图形化PDMS核心结构层的立体结构,并在NHMC的制备过程中添加适量比例的Triton X-100;将优化的EGFR G719S突变扩增体系组分应用于NHMC构建NHMC-d PCR检测平台,并在同等条件下与商用试剂进行比较。（2）根据L858R突变（EGFR突变）、KRAS codon12突变（KRAS密码子突变）和H19突变（长链非编码RNA突变）序列设计并合成相应的q PCR引物,并分别构建以p UC57为载体的含有以上目的序列的突变型质粒,作为待检测的干扰物质。（3）通过检测不同浓度梯度的EGFR G719S突变质粒、白蛋白标准液（血清主要物质）、L858R突变质粒、KRAS codon12突变质粒、H19突变质粒和以上物质的混合物,初步评估NHMC-d PCR平台的线性范围、特异性和抗干扰能力。（4）用NHMC-d PCR、DNA测序和液滴式数字PCR（Droplet Digital PCR,dd PCR）三种方法分别检测6例含有EGFR G719X突变（扩增阻滞突变系统测出）的肺癌组织标本,比较三种方法在临床样本检测中的一致性。【研究结果】1.肺癌EGFR基因突变扩增体系组分的设计和验证（1）根据EGFR G719S野生型和突变型序列设计合成了q PCR引物,并构建了p UC57-G719S W和p UC57-G719S M。（2）采用LNA和MGB双添加的Taq Man探针法设计的EGFR G719S野生型和突变型扩增体系组分特异性高、重复性好。在野生型体系中,p UC57-G719S W的标准曲线扩增效率为97%,而p UC57-G719S M为阴性;在突变型体系中,p UC57-G719S M的标准曲线扩增效率为94.18%,而p UC57-G719S W为阴性;构建的EGFR G719S扩增体系在芯片外进行q PCR的灵敏度为11 copies/μL。（3）EGFR G719S突变扩增体系优化后的最佳参数为:退火温度为56℃,引物及探针的浓度分别为0.9μmol/L和0.5μmol/L。2.NHMC-d PCR平台的建立及在肺癌基因突变检测中的初步应用（1）六棱柱空腔的设计使腔室数量提高至113 137,进样时间减少至5～30 s;除去制作芯片的时间,整个检测过程仅需1.5 h左右。并且进样管道设计的改变解决了由于PDMS真空作用不够导致的油密封不充分的问题。（2）在扩增体系组分中增添合适体积BSA同时在NHMC的配制过程中添加适当比例Triton X-100后,自主构建的EGFR G719S突变扩增体系在NHMC中的应用取得了与商用试剂在NHMC中扩增的同等效果,降低了试剂成本。（3）构建并鉴定了含有目的序列的L858R突变型质粒、KRAS codon12突变型质粒及H19突变质粒。（4）NHMC-d PCR检测EGFR G719S突变的线性范围为3.01×100～3.01×107copies/μL;检测值与期望值的线性方程为Y=0.725X-0.581,线性相关性R2=0.984。NHMC-d PCR检测白蛋白标准液、L858R突变质粒、KRAS codon12突变质粒和H19突变质粒4种干扰物均未发现阳性拷贝,检测G719S突变和其与4种干扰物混合的结果分别为23 194.4 copies和22 095.7 copies。（5）NHMC-d PCR、dd PCR和DNA测序三种方法检测6例临床样本的定性结果符合率为100%,其中2例由NHMC-d PCR定量的结果为1 822.4 copies和451.7 copies,其对应由dd PCR定量的结果为1 581.8 copies和218.3 copies。【结论】本研究建立的NHMC-d PCR平台在EGFR G719S突变检测中具有成本低、检测时间较短、操作简单、特异性好等优点,可用于肺癌基因突变的绝对定量分析。