红毛丹果皮多酚提取物安全性评价及老鹳草素的分离纯化

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本文以新鲜红毛丹果皮为原料,用总酚含量和抗氧化活性指标评价了红毛丹果皮的干燥方式,采用正交设计试验优化了红毛丹果皮多酚(RPP)的提取工艺,进一步用急性毒性试验和亚急性毒性试验评估了RPP提取物的安全性,最后对RPP提取物中的酚类化合物老鹳草素进行了分离纯化,并探究纯化后老鹳草素的光热稳定性,主要研究结果如下:1、通过比较五种干燥方式(40℃鼓风干燥、60℃鼓风干燥、80℃鼓风干燥、真空冷冻干燥和自然风干)的红毛丹果皮中总酚含量和提取液的抗氧化效果(DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和抑制脂质体过氧化能力),确定最佳原料干燥方式为真空冷冻干燥,该干燥方式下提取RPP的量为278.33mg没食子酸(GAE)/g干重(DW)。通过分析单因素试验及正交试验结果,确定最佳RPP的提取工艺参数为:乙醇浓度60%,液料比80 m L/g,超声时间5 min。在最佳条件下,RPP的提取量为293.74 mg GAE/g DW。2、通过急性毒性试验和亚急性毒性试验评价了RPP提取物的安全性。在急性毒性试验中,用5000 mg/kg bw剂量的RPP提取物对昆明小鼠进行染毒,在14天的观察期内并未发现RPP提取物对小鼠有明显的中毒症状和死亡迹象。因此,判定RPP提取物的LD50(Lethal Dose,50%)值大于5000 mg/kg bw。根据急毒试验结论,确定亚急性毒性试验中灌胃RPP的剂量为2500、1250、625和312 mg/kg。对大鼠连续灌胃RPP提取物28天,发现2500 mg/kg剂量的RPP提取物明显抑制了大鼠的体重增长,导致了大鼠的肝脏系数显著增长(p<0.05),脾脏系数显著降低(p<0.05);血液学分析表明,1250和2500 mg/kg bw剂量的RPP提取物会使大鼠免疫功能衰弱,肝脏受损。血清和肝脏生化指标进一步验证了血液分析结果,且发现2500 mg/kg bw剂量的RPP提取物使大鼠的肾脏受损。组织病理学检测发现,2500 mg/kg bw浓度的RPP提取物对肝脏、脾脏、肾脏有不同程度的损伤,主要表现在肝脏细胞凋亡,脾脏细胞白髓减少,肾小管肿胀和肾小球萎缩,从而导致大鼠免疫功能衰弱,丧失肾小球过滤功能,肾小管重吸收能力减弱,丧失吸收离子的能力和严重的组织水肿。3、通过检测老鹳草素在五种干燥红毛丹果皮中的含量,确定最佳的原料干燥方法为真空冷冻干燥。该干燥方法得到的果皮中老鹳草素含量为12.67%(w/w)。RPP提取物经过MPLC反相C18柱洗脱和制备型HPLC纯化可制得纯度为95.63%的老鹳草素产品。老鹳草素经过紫外照射30 min,损失16.98%;60℃处理老鹳草素10 h,损失了17.13%;100℃处理老鹳草素2 h,损失了73.97%。通过对老鹳草素分解产物的分析,发现了七个化合物,鉴定为:云实酸,柯里拉京,没食子酸,Galloyl-bis-HHDP-glucose,鞣花酸,云实素,六羟基联苯二甲酸。
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