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本实验对来源于广东不同地区的196头屠宰猪、359只屠宰山羊鞭虫的感染现状进行了调查,结果发现196头猪中,检出鞭虫感染猪只21头,感染率为10.71%,共收集虫体231条,感染强度为4—20之间;而359只山羊中,检查鞭虫感染羊只83只,感染率为23.12%,共收集虫体335条,感染强度为2—9之间,形态学观察表明猪和山羊感染的种类分别为猪鞭虫(Trichuris suis)和斯氏鞭虫(T. skrjabini)。
在形态学观察的基础上,实验选用不同地区收集的猪鞭虫和斯氏鞭虫作为研究对象,进行虫体基因组DNA的抽提,用能够扩增出多种蠕虫的核糖体DNA(rDNA)间隔区序列(internal transcribed spacer,ITS)的通用引物NC5和NC2,进行猪鞭虫和斯氏鞭虫ITS的PCR扩增和多态性分析。结果获得猪鞭虫ITS—1长为654—656bp,ITS—2长为532—534 bpp;斯氏鞭虫ITS—1长为467bp,ITS—2长为396bp。多态性分析显示,同种鞭虫之间的ITS相对保守,碱基差异很少。而不同种的斯氏鞭虫与猪鞭虫的ITS不仅长度不同,而且碱基差异很大,斯氏鞭虫与猪鞭虫ITS—1的碱基差异率达18.6%—19.7%,ITS—2的碱基差异率达17.2%—20.2%,证明ITS可作为鞭虫种间鉴定的重要遗传标记。而介于ITS—1与ITS—2之间的5.8S相对比较保守,不同虫种之间的长度相同,碱基差异很少,不能作为虫体种间鉴定的遗传标记。
在ITS基因的研究基础上,进一步对广东不同地区的猪鞭虫和斯氏鞭虫mtDNA的plsrRNA、pnad4、p16S、pcox1基因进行PCR扩增和序列分析,结果表明,来源于不同地区的同种鞭虫之间上述四个基因相对保守,差异性不大,但不同种鞭虫之间差异较大。猪鞭虫和斯氏鞭虫的plsrRNA长度分别为430bp与421bp,相互间有78个种间遗传标记位点;猪鞭虫和斯氏鞭虫的pnad4长度均为468bp,相互间有162个种间遗传标记位点;猪鞭虫和斯氏鞭虫的p16S长度均为418bp,相互间有108个种间遗传标记位点;猪鞭虫和斯氏鞭虫的pcox1长度分别为600bp与438bp,相互间有156个种间遗传标记位点。两种鞭虫之间的plsrRNA基因的差异率为20.2%—20.9%;pnad4基因的差异率为45.1%—45.9%;p16S基因的差异率为31.1%—32.7%;pcox1基因的差异率为44.1%—45.4%;其种间序列差异率pnad4>pcox1>p16S>plsrRNA。上述线粒体四个基因都可以作为区分两种线虫的种间遗传标记。
将实验获得序列资料与GenBankTM收录的序列进行比对,以旋毛虫相应基因片段作为外群,采用DNAstar(version3.67)、Dnasp4.0、Mega4.1邻接法(neighbor joining,简称NJ)、最小进化法(Minimum Evolution,简称ME)、最大简约法(Maximum Parsimony,简称MP)、UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)构建进化树进行分析,再利用Treeview查看。系统进化分析表明,本实验所获得猪鞭虫与斯氏鞭虫的线粒体4个基因所得到的进化树具有相似性,两种虫体的种间分群比较明显,种内不同来源的虫株之间没有明显差别。
上述研究结果初步阐明了广东省猪群和山羊鞭虫的感染现状和种类,揭示了猪鞭虫和斯氏鞭虫的分子遗传差异,为鞭虫的分类鉴定提供了重要依据,同时对鞭虫病的流行病学、诊断与防治具有重要的科学意义。