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目的：用加味青蒿鳖甲汤含药兔血清对急性T淋巴细胞白血病完全缓解(Acute T lymphoblastic leukemia complete remission,T-ALL-CR)患者CD34+细胞源树突细胞(Dendritic cells，DCs)诱导，观察诱导后DCs形态及相关抗原分子表达，分析DCs激发正常人、T-ALL-CR患者外周血T细胞对人急性T淋巴细胞白血病CEM细胞的杀伤作用。探讨扶正透毒祛毒复方加味青蒿鳖甲汤干预诱导的T-ALL-CR患者CD34+细胞源DCs对CEM细胞的生物学效应。
方法：1.分别用高、中、低剂量加味青蒿鳖甲汤煎剂早晚定时灌动物胃（健康新西兰大白兔）三天，于末次灌胃后2h在无菌实验室行心脏取血，分别制备高、中、低浓度的复方含药兔血清备用。2.抽取符合纳入实验标准的患者骨髓，在无菌条件下采用Ficoll密度梯度离心获得骨髓单个核细胞(Bone Marrow Nucleated Cells，BMNC)，用CD34+免疫磁珠提纯得到CD34+细胞，加入IL-3、TPO、Flt-3、SCF进行扩增9天，使CD34+细胞呈对数生长后进入DCs诱导。3.通过自动细胞计数仪将CD34+细胞数目调整至1×106个/ml后加入IFN-α、GM-CSF、IL-4、TNF-α联合高、中、低剂量复方含药兔血清共同诱导，共分为五组，即高剂量加味青蒿鳖甲汤+细胞因子组(JWG+XB)、中剂量加味青蒿鳖甲汤+细胞因子组(JWZ+XB)、低剂量加味青蒿鳖甲汤+细胞因子组(JWD+XB)、细胞因子组(XB)、正常兔血清组(ZC)，诱导过程中通过倒置显微镜观察DCs的生长形态并拍照记录。4.9天后将收集的细胞用流式细胞仪(Flow Cytometry，FCM)检测DCs的表面抗原CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR表达。5.分别取患者及正常人外周血各30ml，经Ficoll密度梯度离心获得外周血单个核细胞，磁珠阴性分选法制得纯化的外周血T细胞。6.CEM细胞株接种于10％FBS RPMI1640培养液中，在37℃、5％CO2条件下培养，2～3天传代1次，更换细胞液，取对数生长期细胞。7.用诱导成熟的DCs以10∶1比例与T细胞共同培养以激活T细胞，DCs激活T细胞混合细胞与CEM细胞以10∶1、20∶1、40∶1效靶比培养5天，MTT法检测对CEM细胞的杀伤作用。
结果：1.DCs形态：随着培养周期的延长，观察发现CD34+细胞逐渐聚集，出现不规则突起，形成集落，最终可见较为典型的DCs形态。第0天镜下为CD34+细胞形态，3天后见细胞表面开始出现不规则突起呈细丝状，部分呈簇聚集，形成少量集落;6天后细胞胞体较前变大，形态各异，大小不等，突起不一，集落数及细胞量增多;9天后细胞胞体明显变大，突起明显增多，聚集成团，呈典型树突状细胞特征。其中，不同剂量复方含药兔血清组诱导之DCs形态较ZC和XB典型。
2.DCs免疫表型：诱导第9天后CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR表面抗原在各组中均有表达。除CD1a在JWD+XB与XB比较无统计学差异(P＞0.05)外，余各表面抗原分子在不同剂量复方含药兔血清组的表达均优于ZC及XB(P＜0.05)。XB组的CD1a、CD86表达明显优于ZC组(P＜0.05)。不同剂量复方含药兔血清组之间的表达无明显差异(P＞0.05)。
3.DCs激发正常人、T-ALL-CR患者外周血T细胞对CEM细胞的杀伤作用：在不同效靶比时，不同剂量复方含药兔血清+细胞因子组激活的患者及正常人T细胞对CEM细胞的杀伤率均高于细胞因子组激活的正常人T细胞(XBZ)和正常兔血清组激活的正常人T细胞组(ZCZ)，有统计学意义(P＜0.05)。效靶比10∶1和20∶1时，不同剂量复方含药兔血清+细胞因子组激活患者及正常人T细胞对CEM细胞的杀伤率均高于细胞因子组激活的患者T细胞(XBH)和正常兔血清组激活的患者T细胞组(ZCH)，有统计学意义(P＜0.05)，细胞因子组激活的正常人T细胞(XBZ)和患者T细胞(XBH)对CEM细胞的杀伤率高于正常兔血清组激活的正常人T细胞(ZCZ)和患者T细胞(ZCH)，有统计学意义(P＜0.05)。效靶比20∶1时，JWG+XBZ和JWZ+XBH高于JWD+XBZ和JWD+XBH，有统计学意义(P＜0.05)，JWG+XBH高于JWZ+XBZ和JWZ+XBH，有统计学意义(P＜0.05)。效靶比40∶1时，JWG+XBZ和JWG+XBH高于JWD+XBZ和JWD+XBH，有统计学意义(P＜0.05)，JWG+XBH高于JWZ+XBZ和JWZ+XBH，有统计学意义(P＜0.05)。同组不同效靶比的杀伤率进行比较提示，在JWG+XBH效靶比20∶1和40∶1高于效靶比10∶1，有统计学意义(P＜0.05)。相同效靶比时同一组别的正常人与患者比较无统计学意义(P＞0.05)。
结论：1.加味青蒿鳖甲汤含药兔血清可诱导T-ALL-CR患者CD34+细胞源BMNC为典型的DCs形态。不同剂量复方含药兔血清能促进T-ALL-CR患者CD34+细胞源DCs的成熟，能较高表达DCs表面抗原CD83、CD86、CD80、CD1a、HLA-DR。
2.经加味青蒿鳖甲汤含药兔血清诱导的DCs能激发T-ALL-CR患者及正常人外周血T细胞发挥对CEM细胞的杀伤作用，以高剂量复方含药兔血清组最优，随着效靶比增加其杀伤作用也增强。
方法：1.分别用高、中、低剂量加味青蒿鳖甲汤煎剂早晚定时灌动物胃（健康新西兰大白兔）三天，于末次灌胃后2h在无菌实验室行心脏取血，分别制备高、中、低浓度的复方含药兔血清备用。2.抽取符合纳入实验标准的患者骨髓，在无菌条件下采用Ficoll密度梯度离心获得骨髓单个核细胞(Bone Marrow Nucleated Cells，BMNC)，用CD34+免疫磁珠提纯得到CD34+细胞，加入IL-3、TPO、Flt-3、SCF进行扩增9天，使CD34+细胞呈对数生长后进入DCs诱导。3.通过自动细胞计数仪将CD34+细胞数目调整至1×106个/ml后加入IFN-α、GM-CSF、IL-4、TNF-α联合高、中、低剂量复方含药兔血清共同诱导，共分为五组，即高剂量加味青蒿鳖甲汤+细胞因子组(JWG+XB)、中剂量加味青蒿鳖甲汤+细胞因子组(JWZ+XB)、低剂量加味青蒿鳖甲汤+细胞因子组(JWD+XB)、细胞因子组(XB)、正常兔血清组(ZC)，诱导过程中通过倒置显微镜观察DCs的生长形态并拍照记录。4.9天后将收集的细胞用流式细胞仪(Flow Cytometry，FCM)检测DCs的表面抗原CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR表达。5.分别取患者及正常人外周血各30ml，经Ficoll密度梯度离心获得外周血单个核细胞，磁珠阴性分选法制得纯化的外周血T细胞。6.CEM细胞株接种于10％FBS RPMI1640培养液中，在37℃、5％CO2条件下培养，2～3天传代1次，更换细胞液，取对数生长期细胞。7.用诱导成熟的DCs以10∶1比例与T细胞共同培养以激活T细胞，DCs激活T细胞混合细胞与CEM细胞以10∶1、20∶1、40∶1效靶比培养5天，MTT法检测对CEM细胞的杀伤作用。
结果：1.DCs形态：随着培养周期的延长，观察发现CD34+细胞逐渐聚集，出现不规则突起，形成集落，最终可见较为典型的DCs形态。第0天镜下为CD34+细胞形态，3天后见细胞表面开始出现不规则突起呈细丝状，部分呈簇聚集，形成少量集落;6天后细胞胞体较前变大，形态各异，大小不等，突起不一，集落数及细胞量增多;9天后细胞胞体明显变大，突起明显增多，聚集成团，呈典型树突状细胞特征。其中，不同剂量复方含药兔血清组诱导之DCs形态较ZC和XB典型。
2.DCs免疫表型：诱导第9天后CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR表面抗原在各组中均有表达。除CD1a在JWD+XB与XB比较无统计学差异(P＞0.05)外，余各表面抗原分子在不同剂量复方含药兔血清组的表达均优于ZC及XB(P＜0.05)。XB组的CD1a、CD86表达明显优于ZC组(P＜0.05)。不同剂量复方含药兔血清组之间的表达无明显差异(P＞0.05)。
3.DCs激发正常人、T-ALL-CR患者外周血T细胞对CEM细胞的杀伤作用：在不同效靶比时，不同剂量复方含药兔血清+细胞因子组激活的患者及正常人T细胞对CEM细胞的杀伤率均高于细胞因子组激活的正常人T细胞(XBZ)和正常兔血清组激活的正常人T细胞组(ZCZ)，有统计学意义(P＜0.05)。效靶比10∶1和20∶1时，不同剂量复方含药兔血清+细胞因子组激活患者及正常人T细胞对CEM细胞的杀伤率均高于细胞因子组激活的患者T细胞(XBH)和正常兔血清组激活的患者T细胞组(ZCH)，有统计学意义(P＜0.05)，细胞因子组激活的正常人T细胞(XBZ)和患者T细胞(XBH)对CEM细胞的杀伤率高于正常兔血清组激活的正常人T细胞(ZCZ)和患者T细胞(ZCH)，有统计学意义(P＜0.05)。效靶比20∶1时，JWG+XBZ和JWZ+XBH高于JWD+XBZ和JWD+XBH，有统计学意义(P＜0.05)，JWG+XBH高于JWZ+XBZ和JWZ+XBH，有统计学意义(P＜0.05)。效靶比40∶1时，JWG+XBZ和JWG+XBH高于JWD+XBZ和JWD+XBH，有统计学意义(P＜0.05)，JWG+XBH高于JWZ+XBZ和JWZ+XBH，有统计学意义(P＜0.05)。同组不同效靶比的杀伤率进行比较提示，在JWG+XBH效靶比20∶1和40∶1高于效靶比10∶1，有统计学意义(P＜0.05)。相同效靶比时同一组别的正常人与患者比较无统计学意义(P＞0.05)。
结论：1.加味青蒿鳖甲汤含药兔血清可诱导T-ALL-CR患者CD34+细胞源BMNC为典型的DCs形态。不同剂量复方含药兔血清能促进T-ALL-CR患者CD34+细胞源DCs的成熟，能较高表达DCs表面抗原CD83、CD86、CD80、CD1a、HLA-DR。
2.经加味青蒿鳖甲汤含药兔血清诱导的DCs能激发T-ALL-CR患者及正常人外周血T细胞发挥对CEM细胞的杀伤作用，以高剂量复方含药兔血清组最优，随着效靶比增加其杀伤作用也增强。