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淹水胁迫或低氧胁迫直接影响玉米幼苗根系的发育，它已成为严重阻碍玉米生产的重要非生物胁迫。microRNA（miRNA）在转录后水平上负调控靶基因的表达。植物miRNA在响应各种非生物胁迫中都扮演了重要角色。本课题组前期研究表明，zma-miR528可能是参与玉米根系发育和淹水胁迫响应调控的miRNAs之一。但zma-miR528响应淹水胁迫的分子机理仍不清楚。 本研究以B73为材料，分析zma-miR528对不同激素和非生物胁迫的响应。进一步地，我们对不同玉米自交系中zma-miR528启动子区的变异及其与淹水胁迫响应的关系进行了研究，鉴定调控zma-miR528对淹水胁迫响应的顺式作用元件;利用酵母单杂交技术，筛选作用于特异性顺式作用元件的反式作用因子，以期阐明调控zma-miR528响应淹水胁迫的分子机理。主要研究成果如下: 1.利用Stem-loop RT-qPCR，分析不同条件下B73zma-miR528的表达，结果表明，B73幼苗根系zma-miR528受ABA、NAA、GA3、KT、Ethylene、NaCl、10℃低温多种激素和非生物胁迫诱导表达。 2.采用PCR技术，在140份玉米自交系中，分别获得130个zma-miR528a的启动子序列和122个zma-miR528b的启动子序列。以B73的zma-miR528启动子为参考序列，比较分析表明，zma-miR528a/b启动子序列具有遗传多样性，主要表现在zma-miR528a启动子序列-1429 bp至-1647 bp存在218 bp的缺失，zma-miR528b启动子序列在-637/-636 bp存在1077 bp的插入、在-363/-362 bp存在248 bp的插入。根据启动子序列的比对结果，将启动子序列大体分为2类序列变异:一类是，类似于B73和Mo17的zma-miR528启动子序列;另一类是，类似于Hz32的zma-miR528启动子序列。 3.在130份自交系中，共检测到zma-miR528a启动子序列有100个多态性位点，包括22个InDels，78个SNPs。在122份自交系中，共检测到zma-miR528b启动子序列有60个多态性位点，包括12个InDels，48个SNPs。关联分析表明，与zma-miR528淹水胁迫下的表达显著关联的位点有8个，其中6个位点位于zma-miR528a启动子区，2个位点位于zma-miR528b启动子区。各启动子内的位点高度连锁不平衡。8个位点主要形成4种单倍型，其中，zma-miR528a启动子的6个位点的等位基因型主要形成haplotype1和haplotype2两种单倍型，zma-miR528b启动子的2个位点的等位基因型主要形成haplotype3和haplotype4两种单倍型。zma-miR528淹水胁迫下的表达变化，在单倍型haplotype1和haplotype2的玉米自交系中具有极显著的差异，在单倍型haplotype3和haplotype4的玉米自交系中也具有极显著的差异。我们将检测到的8个位点作为调控zma-miR528淹水胁迫下表达的候选功能位点。 4.在haplotype1序列中，预测到顺式作用元件RHERPATEXPA7，并存在与转录因子OBP和OBF结合的顺式作用元件具有同源性的2个motif,且转录因子OBP是转录因子OBF的结合蛋白;在haplotype2序列中，预测到顺式作用元件LTRECOREATCOR15，并存在与顺式作用元件ABRELATERD1具有同源性的3个motif。在haplotype3和haplotype4序列中没有预测到顺式作用元件。 5.已完成酵母单杂交文库的构建，并以B73zma-miR528a启动子构建了含有haplotype1序列的pBait-AbAi载体:p528a1-AbAi，以B73zma-miR528a启动子-545 bp至-10 bp为bait序列;以Hz32zma-miR528a启动子构建了含有haplotype2序列的pBait-AbAi载体:p528a2-AbAi，以Hz32zma-miR528a启动子-526 bp至10 bp为bait序列。Bait-AbAi载体已成功转化到Y1H Gold酵母菌株中，目前正在进行酵母单杂交文库的筛选工作。