前言　　 肝纤维化是继发于肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿性反应,也是向肝硬化发展的主要中间环节,肝纤维化最终可发展为肝硬化甚至肝癌。肝纤维化有逆转的可能性,因此,在此阶段的有效治疗无疑是肝硬化甚至肝癌防治工作的重中之重。　　 α-干扰素(Interferon-alpha,IFN-α)是由白细胞、成纤维细胞和病毒感染的组织细胞产生并分泌的一类具有多种生物活性的糖蛋白,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。目前,临床上已用于治疗肝纤维化,但具体抗纤维化机制尚不明确。　　 四氯化碳(CCl4)致使小鼠肝纤维化为探讨IFN-α抗小鼠肝纤维化免疫应答机制提供了一个宝贵的实验动物模型。在肝纤维化发生、发展过程中,多种免疫细胞通过合成分泌不同的细胞因子、趋化因子等化学介质介导免疫炎症反应。在各种因素导致的炎症反应急性阶段,受损肝细胞、内皮细胞及被激活的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)可分泌多种细胞因子和趋化因子,趋化肝组织及血循环中的天然免疫细胞(单核巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞)及获得性免疫细胞(T细胞和B细胞)浸润损伤部位,介导急性期的免疫炎症反应及损伤组织的修复反应;在慢性炎症阶段,炎症反应和组织修复循环交替、HSC持续激活、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成与分解代谢失衡,过度沉积于肝脏,导致肝纤维化。细胞因子、趋化因子与免疫细胞共同构成影响肝星状细胞的免疫微环境。用药物总体调节肝脏的免疫微环境,诱导免疫细胞向逆转肝纤维化的功能方向发展,可能成为治疗肝纤维化的一种新思路,对阐明肝纤维化发病机制及探索肝纤维化治疗靶点具有重要意义。　　 我们利用成功建立的小鼠肝纤维化模型,分析了参与肝纤维化发生、发展及结局的免疫应答调控的相关因素,动态观察IFN-α不同剂量组在不同治疗周期对小鼠肝纤维化结局的影响、肝(局部)脾(全身)免疫效应细胞及产生细胞因子的变化,以期为肝纤维化的治疗提供新的靶点。　　 实验方法　　 1、实验动物及主要试剂　　 6～8周龄、雌性BALB/c小鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供(许可证编号:SCXK京200420001);四氯化碳(CCl4):分析纯,上海长江化工厂;橄榄油:山东鲁花集团产品;注射用重组人IFN-α2b:购自美国先灵葆雅,批号:010L30201;苏木素、伊红购自美国Sigma公司;Masson三色胶原试剂盒及即用型SP超敏试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司;流式单克隆抗体:购自美国BD公司及eBioscience公司。　　 2、动物模型制作、分组及相应处理　　 (1)制作肝纤维化小鼠模型:腹腔注射10%CCl4(橄榄油稀释)5μl/g,2次/周,共8周(前两次剂量减半)。　　 (2)分组及治疗:将肝纤维化小鼠分为A组(生理盐水组)、B组(IFN-α低剂量组)、C组(IFN-α中剂量组)、D组(IFN-α高剂量组),分别给予治疗。另设正常对照组E组。注:A组:0.9%注射用水;B组:IFN-α400U/只,100μl;C组:IFN-α800U/只,100μl;D组:IFN-α1200U/只,100μl。隔日皮下注射,现用现配(前三次剂量减半)。　　 3、病理切片制作　　 杀鼠取其肝脏,在肝左叶组织同部位取2块,每块组织约1cm×1cm×0.5cm大小,立即放入10%甲醛溶液中固定保存,备检。切片做病理HE染色和MASSON染色。　　 4、脾细胞培养　　 α-干扰素治疗小鼠三周、六周和八周常规无菌取出脾脏,用10ml含5%热灭活FCS的RPMI1640培养液制成细胞悬液,350×g,室温离心10分钟。经0.17MNH4Cl裂解红细胞、RPMI1640洗涤2次,以台盼蓝检查脾细胞活性,确定活细胞超过90%。用含10%热灭活FCS的RPMI1640将脾细胞终浓度调至1×107个/ml,24孔培养板(FALCON),每孔加入500μl细胞悬液,一式3孔,培养48h。350×g室温离心10min,收集上清,-80℃保存,待细胞因子测定。　　 5、流式细胞仪检测小鼠肝脏及脾脏细胞　　 FACS检测CD11c+CD11b+DCs(mDCs)、CD11c+B220+DCs(pDCs)、CD4+CD69+T细胞、CD4+CD25+Foxp3+T细胞(Tregs)、F4/80巨噬细胞。　　 6、细胞因子检测　　 双抗体夹心ELISA法对小鼠脾细胞培养上清IFN-γ、IL-10及TGF-β的含量分别进行检测,酶标仪(InterMedNJ-2100)测定450nm处OD值。绘制标准曲线,计算细胞因子含量(pg/ml)。　　 7、统计学分析　　 实验数据用SPSS17.0统计软件处理,对各个实验组数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA分析)及多重比较(Dunnett-t检验),P＜0.05有统计学差异。　　 实验结果　　 1、IFN-α对肝纤维化小鼠肝组织病理的影响　　 造模成功与否判断:造模6周及8周后分别取2只鼠,取肝脏做病理HE染色验证其肝纤维化模型是否成功。汇管区周围纤维化明显,有芒状纤维和纤维间隔形成。中度肝纤维化形成即可。(纤维隔形成并互相连接深入小叶内,小叶结构保留或紊乱,但无肝硬化。)　　 与生理盐水组相比,IFN-α高、中及低剂量治疗组肝组织纤维化程度明显好转,尤其是中剂量治疗组疗效在治疗六周时更加显著。　　 2、IFN-α对肝纤维化小鼠治疗过程中相关免疫细胞的影响　　 治疗三周,生理盐水组小鼠肝脏mDC百分比显著高于正常组、IFN-α中剂量组(P＜0.05)。整个治疗周期,各组问小鼠脾脏mDC、脾脏及肝脏pDC未见有意义的差别。组间小鼠脾脏活化T细胞未见有意义的差别。治疗八周后,生理盐水组小鼠肝脏活化T细胞百分比显著高于IFN-α低、中及高剂量组(P＜0.05)。组间小鼠肝脏巨噬细胞未见显著差别,但可见各治疗组肝脏巨噬细胞有下降的趋势。治疗三周后,生理盐水组小鼠脾脏巨噬细胞百分比显著高于IFN-α低、中和高剂量组(P＜0.05)。整个治疗周期,IFN-α三个剂量组小鼠肝脏Treg高于正常组和生理盐水组,相反,治疗八周后,生理盐水组小鼠脾脏Treg显著高于IFN-α中、高剂量组(P＜0.05)。　　 3、IFN-α对肝纤维化小鼠治疗过程中相关免疫分子的影响　　 在治疗初期,生理盐水组IL-10浓度显著高于IFN-α中、高剂量组(P＜0.05)。治疗六周时,IFN-α中、高剂量组IL-10浓度显著增高。治疗初期,肝纤维化小鼠脾上清TGF-β浓度均高于正常组,治疗六周后,IFN-α中、高剂量组TGF-β浓度显著下降(P＜0.05),近于正常。IFN-α治疗组小鼠脾上清IFN-γ浓度均高于生理盐水组,治疗六周后,IFN-α中剂量组小鼠脾上清IFN-γ浓度显著高于生理盐水组(P＜0.05)。提示IL-10、IFN-γ均有抗肝纤维化作用,而TGF-β存在促肝纤维化作用。　　 结论　　 1、IFN-α存在直接抗肝纤维化作用,尤其是中剂量组在治疗六周效果更为显著。　　 2、IFN-α下调肝脏mDC数量,上调肝脏Treg的数量而抗肝纤维化。　　 3、IFN-α通过使脾脏(全身)TGF-β下调,IFN-γ上调,使活化T细胞更多向Th1分化进而抑制肝纤维化。