背景脑梗死的治疗一直是医学界的难题,传统的治疗无法修复受损的脑组织。神经干细胞(neural stem cells)的发现为解决该难题带来了新的切入点,但神经干细胞在存活增殖等诸多方面的复杂机制使得神经干细胞的应用研究仍无突破性进展。脑梗死后神经干细胞在原位被激活增殖,表现为梗死区谷氨酸(glutamate)浓度升高,神经干细胞内Shh(sonic hedgehog)蛋白表达量也显著增加；联系到Shh信号通路在胚胎干细胞增殖中的重要作用,我们推测Glu可能经由Shh信号通路介导了神经干细胞的增殖。因此本实验拟通过体外实验探索Shh表达与Glu刺激神经干细胞增殖的关系。本实验分三部分：第一部分成年SD大鼠神经干细胞分离培养和鉴定的改良目的改良成年SD大鼠神经干细胞分离、培养和鉴定方法,观察神经干细胞的增殖和分化特点,为后续实验提供细胞。方法从成年SD大鼠分离出完整海马,采用机械吹打法获得原代细胞,用accutase消化传代,利用CCK-8法检测神经干细胞的增殖情况,应用多重标记免疫荧光细胞化学方法鉴定神经干细胞及其诱导分化后细胞。结果机械吹打法可获得原代神经干细胞,accutase消化传代有利于神经干细胞的传代培养,CCK-8法能够测定神经干细胞的增殖,多重免疫荧光展现了成年神经干细胞经胎牛血清诱导后的诱导分化过程。结论改良后的培养方法可以更加简单高效的获得和培养出大量细胞,经多重免疫荧光鉴定所分离和培养的细胞是神经干细胞。第二部分谷氨酸刺激神经干细胞增殖的最适浓度探索目的用不同浓度的谷氨酸刺激成体神经干细胞增殖,寻求最适合的谷氨酸浓度,为后续试验做准备。方法取传代3代以后的神经干细胞,在含有不同浓度谷氨酸的去生长因子培养基中培养24h、48h、72h,采用CCK-8法检测不同谷氨酸浓度下神经干细胞的增殖情况。结果0μmol/L～1OOμmol/L浓度范围的谷氨酸对成体神经干细胞有增殖作用,20μmol/L谷氨酸浓度最适合成体神经干细胞的增殖,当谷氨酸浓度大于100μmol/L时将抑制成体神经干细胞的增殖,并对成体神经干细胞具有一定的细胞毒性。结论在体外培养条件下,谷氨酸在一定浓度范围内的(Oμmol/L～100μmol/L)可以刺激成体神经干细胞的增殖,刺激成体神经干细胞增殖的最适浓度为20μmol/L；当谷氨酸浓度大于100μmol/L时将抑制成体神经干细胞的增殖,并对成体神经干细胞具有一定的细胞毒性。第三部分谷氨酸经Shh信号途径对神经干细胞的增殖作用目的用2Oμmol/L谷氨酸刺激成体神经干细胞的增殖,探索Shh表达与谷氨酸刺激成体神经干细胞增殖的关系。方法取传代3代以后的神经干细胞,在终浓度为20μmol/L谷氨酸的除生长因子的培养基中分别培养24h、48h、72h,设为Glu刺激24h、48h、72h3组,在未加谷氨酸的除生长因子培养基中培养72h,设为空白对照组；按上述分组方法另设一组在相应时间分别加入胎牛血清诱导分化培养1周,观察神经干细胞及诱导分化后细胞增殖情况,采用westemblot法检测nestin蛋白、Shh蛋白、GFAP蛋白及βⅢ-tubulin蛋白的表达情况,采用实时荧光定量法检测nestin mRNA、Shh mRNA、 GFAP mRNA及βⅢ-tubulin mRNA表达情况。结果在谷氨酸刺激成体神经干细胞的增殖过程中,nestin表达量变化与Shh表达量变化相一致。诱导分化后1周神经干细胞大部分分化为神经元和神经胶质细胞。结论Shh信号通路可能参与了谷氨酸刺激成体神经干细胞增殖的过程；谷氨酸刺激神经干细胞增殖不影响成体神经干细胞的分化潜能。