Wnt/β-catenin信号通路调控哮喘气道重塑机制研究

来源 :温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhuxiangyuzhucendsc
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目的:  1.通过研究转录辅助因子p300/CBP与β-连环蛋白(β-catenin)信号通路间相互作用对气道平滑肌细胞(airway smooth muscle, ASMC)增殖活性的调控,探讨Wnt/β-catenin信号通路是否通过影响ASMC的增殖活性,参与哮喘气道重塑过程。  2.探讨原癌基因 c-Myc、细胞周期蛋白 D1(CyclinD1)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3β, GSK-3β)与Wnt/β-catenin信号通路在哮喘气道重塑形成过程中的关联性。  3.研究丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路与Wnt/β-catenin信号通路在哮喘气道重塑过程中的相互作用。  方法:  选取无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠16只,年龄为6周,体重为180~220g,随机分成正常对照组和哮喘气道重塑组两组进行实验。哮喘气道重塑组大鼠用鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)作为致敏药物,经过致敏和激发共10周建立大鼠哮喘模型。正常对照组大鼠予以生理盐水溶液作为替代,进行相应处理。末次激发后处死大鼠并观察肺组织大体外观,苏木精-伊红染色(hematoxylin and eosin staining,HE)染色观察两组大鼠肺组织的病理结构,同时提取ASMC,通过细胞免疫组化SP法鉴定细胞,确定为ASMC。提取的原代细胞经传代培养后取3~5代细胞进行实验,免疫印迹(Western blot)法检测哮喘组和正常组大鼠ASMC中β-catenin、GSK-3β、c-Myc和CyclinD1蛋白的表达,实时定量-聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测两组ASMC中β-catenin、GSK-3β、c-Myc和CyclinD1 mRNA的表达。分别使用特异性β-catenin/CBP和β-catenin/p300抑制剂干预培养两组ASMC后,使用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)法检测各组ASMC增殖活性的变化,流式细胞术检测各组ASMC各细胞周期内DNA含量的变化。使用特异抑制剂抑制ASMC中p38MAPK信号通路活性后,进一步使用Western blot法检测β-catenin、c-Myc和CyclinD1蛋白表达量的变化  应用SPSS22.0软件进行数据统计分析,计量数据资料以均数±标准差( x± s)表示,两组样本之间的均数比较采用t检验,两变量之间相关性分析采用直线相关分析法,单个因素的多组样本均数比较采用单因素方差分析;进一步两两比较采用LSD检验,P<0.05表示差异有显著性。  结果:  1.光镜下显示两组大鼠肺组织病理学改变  正常对照组大鼠肺组织HE染色显示正常小气道和肺泡结构,肺组织结构完整,黏膜上皮完整,支气管管腔规则,支气管、血管周围未见炎性细胞的浸润。哮喘气道重塑组大鼠肺组织HE染色显示气道壁明显增厚,基底膜不规则增厚,黏膜褶皱增多,出现上皮杯状细胞增生和上皮细胞脱落,可见黏液腺增生、黏液栓形成和黏膜下水肿,管腔内可见渗出物和炎性细胞增多,支气管黏膜下、支气管和血管周围可见嗜酸性粒细胞(EOS)、中性粒细胞和淋巴细胞等炎症细胞的广泛浸润。  2.细胞免疫组化SP法鉴定细胞  对大鼠ASMC使用细胞免疫组化SP法进行特异的平滑肌α-actin免疫细胞化学染色后,镜下观察:95%以上细胞呈强阳染色,胞浆呈棕黄色或棕红色,证实为ASMC。  3. CCK-8细胞增殖实验检测ASMC增殖率变化  哮喘组和正常组 ASMC经不同浓度的特异性抑制剂阻断 p300/CBP与β-catenin间的相互作用后,两种ASMC的增殖率均下降,并且在相同处理条件下,哮喘气道重塑组的ASMC增殖率下降幅度较正常对照组更为明显,差异具有显著性(P<0.05)。  4.流式细胞术检测细胞周期  正常组ASMC经特异性抑制剂阻断p300/CBP与β-catenin信号通路间的作用后,与无处理对照组相比,各处理组ASMC的G0/G1期DNA百分比少量增加, S期相应减少,但差异不具有显著性(P>0.05),而哮喘组ASMC经抑制剂作用后,与无处理组相比,各处理组ASMC的G0/G1期DNA百分比增加,S期和G2/M期亦明显下降,差异均具有显著性(P<0.05)。  5.气道重塑相关物质表达量分析  5.1 Western Blot法检测两组ASMC中β-catenin、GSK-3β、c-Myc和CyclinD1蛋白表达量的变化,结果显示哮喘气道重塑组和正常对照组ASMC中β-catenin蛋白的相对灰度值分别为(0.49±0.16)和(0.27±0.06),差异有显著性(P<0.05)。哮喘气道重塑组和正常对照组ASMC中GSK-3β蛋白的相对灰度值分别为(0.30±0.08)和(0.75±0.33),差异有显著性(P<0.05)。哮喘气道重塑组ASMC中c-Myc蛋白(0.44±0.04)的表达与正常对照组(0.25±0.11)相比表达明显增多,差异有显著性(P<0.01)。两组大鼠ASMC中CyclinD1蛋白相对灰度值比较,哮喘气道重塑组(0.35±0.02)的表达与正常对照组(0.17±0.03)亦存在显著性差异(P<0.01)。  5.2 RT-qPCR法检测两种ASMC中β-catenin、GSK-3β、c-Myc、CyclinD1 mRNA表达量变化,结果显示与对照组相比,哮喘组β-catenin、c-Myc和CyclinD1的表达量均显著上升,而GSK-3β表达量下降,各组差异均具有显著性(P<0.05)。  5.3阻滞MAPK信号通路后,Western Blot法检测β-catenin、CyclinD1和c-Myc等物质的蛋白表达量,发现β-catenin,CyclinD1和c-Myc表达量较无处理组均明显下降,并表现为浓度依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。  6.相关性分析  6.1哮喘大鼠ASMC中c-Myc蛋白的表达与β-catenin蛋白的表达呈显著正相关(r=0.866,P<0.01,n=8)。  6.2哮喘大鼠ASMC中CyclinD1蛋白的表达与β-catenin蛋白的表达呈显著正相关(r=0.816,P<0.05,n=8)。  结论:  1.在哮喘气道重塑过程中,Wnt/β-catenin信号通路的激活以及β-catenin与p300、CBP间的结合是引起ASMC增殖的重要因素之一。  2.CyclinD1和c-Myc可能通过Wnt/β-catenin信号通路,影响ASMC功能,参与哮喘气道重塑的形成。  3.Wnt/β-catenin信号通路与MAPK信号通路相互作用,共同参与哮喘气道重塑过程。
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