第一章、小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外分离扩增及鉴定 目的：探讨小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外进行分离、纯化及鉴定的方法。 方法：采用密度梯度离心法结合贴壁细胞分离法培养小鼠MSCs，观察不同代细胞的形态及生长情况，流式细胞术检测小鼠MSCs表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106等的表达情况，并对小鼠MSCs进行纯度测定。 结果：小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）原代培养接种24小时后可见圆形细胞贴壁，72小时后贴壁细胞数量明显增多，此时贴壁的细胞形态比较均一，为长梭形。在细胞培养的2～5天细胞增殖较慢，6～10天细胞快速增殖，呈“旋涡样”排列。培养至11～13天，细胞接近80～90%融合，细胞形态均一。传代后的小鼠MSCs呈梭形的成纤维细胞样形态，传代培养后的细胞不再以集落方式生长，而呈均匀性分布生长。分离纯化后所得细胞活力为93.2±1.8%。流式细胞仪结果显示第2代小鼠MSCs细胞均一性较好，在95%以上；CD34、CD45表达阴性，CD105、CD106表达阳性。 结论：采用密度梯度离心法结合贴壁细胞分离法体外分离和扩增小鼠MSCs，所得小鼠MSCs活力及纯度均较高，可以作为小鼠MSCs的原代培养的常规方法；流式细胞技术可以鉴定体外分离培养的小鼠MSCs。 第二章、骨髓间充质干细胞体外诱导分化的非接触共培养模型 目的：建立体外非接触共培养诱导小鼠MSCs向肺泡上皮细胞分化的实验模型。 方法：采用密度梯度离心法结合贴壁细胞分离法，体外分离培养小鼠MSCs，选取第3代小鼠MSCs。无菌条件下制备肺组织单细胞悬液。将小鼠肺细胞悬液接种于0.4um孔径（Millpore）大小的膜上（悬挂式体外共培养小室），并放入24孔板中，在24孔板的底部接种小鼠MSCs。共设计三组：对照组：小鼠MSCs单独静置培养组；实验组A：正常肺组织单细胞悬液+MSCs：实验组B：损伤组肺组织单细胞悬液+MSCs。共同培养8天，每日倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况，透射电镜观察MSCs的细胞超微结构，激光共聚焦显微镜和荧光显微镜观察共培养体系下室MSCs、SP-C和AQP5免疫荧光表达，RT-PCR检测共培养体系下室中SP-C和AQP5 mRNA表达情况。 结果：小鼠MSCs的细胞生长情况：对照组：细胞增殖良好，形态不变，为长梭形，见个别宽大、扁平的细胞。实验组A：共同培养的前4天，细胞形态基本为长梭形，第5天开始见少量细胞变为立方形，并进而转变为多角形，共同培养8天，可见约30～40%的细胞转变为多角形细胞。实验组B：第2天开始，即可见部分细胞由长梭形逐渐变为立方形，并进而转变为多角形，体积增大，随着培养时间的延长，这种多角形细胞逐渐增多。培养8天时，大约60～70%的细胞转变为多角形细胞。不同处理组小鼠MSCs的增值情况比较显示：实验组B与对照组和实验组A比较，共培养体系的下室中的细胞数目明显增多（P<0.05）；但实验组A与对照组比较，各相应时间点相均无明显差异（P>0.05）。不同处理组小鼠MSCs细胞超微结构：对照组和实验组A均未见到肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性标记物板层小体；实验组B，可见较多细胞胞浆内有板层小体。 结论：本实验室成功建立体外非接触共培养诱导小鼠MSCs分化为肺泡上皮细胞的实验模型，并证实损伤的肺组织可以促进小鼠MSCs诱导分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）。 第三章、角化细胞生长因子对骨髓间充质干细胞体外诱导分化的影响 目的：观察角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）对体外小鼠MSCs向肺泡上皮细胞诱导分化的影响。 方法：同第二章。共设计三组：对照组：小鼠MSCs单独静置培养+KGF（10μl/ml）；实验组A：正常肺组织单细胞悬液+MSCs+KGF（10μl/ml）；实验组B：损伤肺组织单细胞悬液+MSCs+KGF（10μl/ml）。观察指标也同第二章。 结果：小鼠MSCs的细胞生长情况：镜下观察共同培养8天细胞情况：对照组：细胞增殖良好，大多数为长梭形细胞；实验组A：可见约40～50%的细胞转变为多角形细胞；实验组B，大约70～80%的细胞转变为多角形细胞，细胞呈多层重叠生长，细胞之间界限模糊。细胞计数显示实验组B各培养时间点，比实验组A和对照组的细胞数目明显增多（P<0.05）；但实验组A与对照组相比较无明显差异（P>0.05）。不同处理组小鼠MSCs细胞超微结构：透射电镜观察，对照组和实验组A的共培养下室中均未见到肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性标记物板层小体；而实验组B细胞胞浆内见有较多板层小体。于共培养第8天观察各处理组小鼠MSCs、SP-C和AQP5的免疫荧光表达：对照组和实验组A都只检测到hoechst33342标记的MSCs的蓝色荧光，AQP5的红色荧光，而未见到绿色的SP-C的荧光；但在实验组B，则可同时检测到hoechst33342标记的MSCs的蓝色荧光，AQP5的红色荧光，以及绿色的SP-C的荧光。RT-PCR检测MSCs中SP-C和AQP5 mRNA表达情况：于1、5、8天检测各处理组的AQP5和SP-CmRNA的表达情况，对照组在共培养开始第1天，可检测到AQP5的mRNA表达，但AQP5的表达比较弱，不同时间段差异不明显，而在不同时间段SP-C都没有表达。 结论：在与损伤肺组织共同培养体系中，角化细胞生长因子（KGF）可以促进小鼠MSCs向肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）诱导分化。 第四章、地塞米松对骨髓间充质干细胞体外诱导分化的影响 目的：观察地塞米松（Dexamethasone）对体外小鼠MSCs向肺泡上皮细胞诱导分化的影响。 方法：实验方法同第二章，观察指标也同第二章。实验分组：共分6组，每组6孔。于下列共培养体系中，细胞培养液所加入的Dex的浓度为10-8mol/L，KGF浓度为10ul/ml。对照组A：MSCs+Dex，实验组A：正常肺组织单细胞悬液+MSCs+Dex，实验组B：损伤肺组织单细胞悬液+MSCs+Dex，对照组B：MSCs+Dex+KGF，实验组C：正常肺组织单细胞悬液+MSCs+Dex+KGF，实验组D：损伤肺组织单细胞悬液+MSCs+Dex+KGF。 结果：小鼠MSCs的细胞生长情况：小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）培养系统中，在细胞培养液中同时加Dex和KGF，培养8天，比单独加入Dex细胞增值情况好，多角形细胞比较多（P<0.05）。而损伤的肺组织单细胞悬液共培养系统比其它处理组细胞增值更加良好，有更多的多角形细胞（P<0.05）。不同处理组小鼠MSCs细胞超微结构：小鼠MSCs+Dex培养系统，加入正常肺组织，以及小鼠MSCs+KGF+Dex培养系统，加入正常肺组织，均未见到有肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体表达。但在这两个共培养系统中加入损伤肺组织悬液时，小鼠MSCs+Dex培养系统的共培养下室可见少部分细胞胞浆内见到板层小体。而小鼠MSCs+KGF+Dex培养系统下室中，则见到较多的细胞胞浆中有肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体。于共培养第8天，观察不同处理组小鼠MSCs中的SP-C、AQP5的免疫荧光表达：对照组A和实验组A都只检测到hoechst33342标记的MSCs的蓝色荧光，AQP5的红色荧光，而未见到绿色的SP-C的荧光；而在实验组B，则可同时检测到hoechst33342标记的MSCs的蓝色荧光，AQP5的红色荧光，以及绿色的SP-C的荧光。比细胞培养液中未加入Dex，表达荧光的细胞稍减少。在培养液中同时加入Dex和KGF，对照组B和实验组C都只检测到hoechst33342标记的MSCs的蓝色荧光，AQP5的红色荧光，而未见到绿色的SP-C的荧光；培养体系中表达荧光的细胞相应比单独加Dex增多。实验组D，则可同时检测到hoechst33342标记的MSCs的蓝色荧光，AQP5的红色荧光，以及绿色的SP-C的荧光。培养体系中表达荧光的细胞相应比单独加Dex明显增多。RT-PCR检测MSCs中SP-C和AQP5 mRNA表达情况：在细胞培养液中未加入Dex，于培养1、5、8天检测各处理组的AQP5和SP-C mRNA的表达情况，对照组A和实验组A可检测到AQP5的mRNA表达，而在不同时间段SP-C都没有表达。实验组B在共培养的各时间段可同时检测到AQP5和SP-C mRNA的表达。在培养液中同时加入Dex和KGF，于培养1、5、8天检测各处理组的AQP5和SP-C mRNA的表达情况，对照组B和实验组C可检测到AQP5的mRNA表达，没有SP-C mRNA的表达。实验组D在共培养的各时间段可同时检测到AQP5和SP-C mRNA的表达。 结论：本实验的研究表明：在损伤的肺组织微环境中，地塞米松（Dex）单独或与角化细胞生长因子（KGF）共同作用时，都可以促使共培养体系中的小鼠骨髓（MSCs）向肺泡Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）诱导分化。