论文部分内容阅读
油菜素内酯(BRs)是调节植物生长发育的重要激素,而类固醇脱氢酶是催化BR生物合成的关键酶,拟南芥DET2是功能研究比较清楚的类固醇脱氢酶,其基因失去功能突变会导致拟南芥(Arabidopsis thaliana)矮化和育性降低。大豆(Glycine max)是我国重要的粮油作物,已有研究表明,BR具有调节大豆生长发育及耐受逆境能力,但对大豆BR生物合成的分子机制还不清楚。本研究鉴定了大豆类固醇脱氢酶基因家族,并对DET2a与DET2b对养分胁迫以及外源BR的响应进行了分析;对植物类固醇脱氢酶家族进行了进化分析和选择压力分析;最后通过遗传互补实验,证明大豆DET2a和DET2b与拟南芥DET2基因具有相似的功能。主要研究结果如下:(1)大豆基因组共有8个类固醇脱氢酶基因,分别命名为Gm DET2a-2h,其中Gm DET2a和Gm DET2b与拟南芥DET2基因亲缘关系最近,Gm DET2a和Gm DET2b基因,分别位于7号和11号染色体,均编码长度为263个氨基酸残基的蛋白;系统进化树分析表明其与Ps DET2、At DET2有很高的同源性;对105种植物类固醇脱氢酶进行进化分析,发现植物类固醇脱氢酶家族分为5个亚组,在进化过程中受到净化选择。(2)荧光定量PCR检测发现,Gm DET2a和Gm DET2b在大豆幼苗期各个器官均有表达。在幼苗期,Gm DET2a在主根根尖和顶芽表达量显著高于其它部位;Gm DET2b在主根根尖、顶芽和侧根表达量显著高于其它部位。(3)用表油菜素内酯(EBL)处理幼苗期大豆,结果表明Gm DET2a在顶芽、真叶、主根根尖和侧根表达量与对照组比显著下调,分别降低了38%、55%、70%和67%;Gm DET2b在主根根尖和侧根表达量与对照比显著下调,均降低了61%。这表明大豆DET2基因表达受BR负反馈调节。(4)幼苗期大豆在不同养分条件下Gm DET2a和Gm DET2b的表达量,结果表明:与对照相比,缺硫条件下,Gm DET2a在叶部表达量显著下调,降低了63%,Gm DET2b在叶部和根部表达量均显著下调,且分别降低了55%和86%;在缺磷条件下Gm DET2b在叶部和根部表达量均显著上调,且分别增加70%和89%;在氮、钾营养元素缺乏的条件下Gm DET2a和Gm DET2b的表达量与对照组相比无明显变化。(5)亚细胞定位试验表明,Gm DET2a和Gm DET2b可能定位于内质网。(6)将Gm DET2a和Gm DET2b在拟南芥det2-1突变体过量表达,导致转基因植物的株高均比突变体高,并恢复至野生型(Col-0)水平,这种差异在突变体回补株系Gm DET2a OX-23和Gm DET2b OX-16中尤为明显。参与BRs生物合成的相关酶基因CPD、DWF4、BR6ox1、BR6ox2的基因转录水平与突变体植株相比有不同程度的下调,其表达量与Col-0相似。(7)黑暗条件下,转基因株系Gm DET2a OX-20、Gm DET2a OX-23、Gm DET2b OX-16和Gm DET2b OX-23的黄化苗下胚轴均比突变体det2-1的下胚轴长,且分别增加了110%、87%、146%和121%,与野生型黄化苗下胚轴长度相似;近子叶处弯钩与野生型形态相似。综上所述,本研究鉴定了大豆类固醇脱氢酶家族,揭示了植物类固醇脱氢酶进化及选择压力,明确大豆DET2a和DET2b功能与拟南芥DET2功能相似,编码催化BR合成的类固醇脱氢酶。为今后进一步研究大豆BR生物合成的分子机理和Gm DET2的功能打下了基础。