Ⅰ型干扰素受体1(IFNAR1)基因敲除猪肾上皮细胞系构建

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Ⅰ型干扰素是天然免疫系统中发挥关键作用的细胞因子。Ⅰ型干扰素受体(Interferon-α/β receptor,IFNAR)结合配体Ⅰ型干扰素后激活下游JAK-STAT等信号转导途径,诱导干扰素诱导基因(Interferon stimulated gene,ISG)转录。低亲和力Ⅰ型干扰素受体 1(Type Ⅰ IFN receptor 1,IFNAR1)是保障完整IFNAR活化必不可少的组成部分。本试验以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建IFNAR1基因稳定敲除猪肾上皮PK15细胞系。首先设计单链引导RNA(Single guide RNA,sgRNA)构建重组质粒plFNAR1-sgRNA;然后将重组质粒与pMD2.G和psPAX2慢病毒包装质粒共转到人胚胎肾细胞(Human embryonic kidney 293T/17,HEK293T/17)收取慢病毒液;用该慢病毒液感染PK15细胞并通过嘌呤霉素(Puromycin,Puro)筛选获得IFANR1基因敲除的多克降细胞系;最终通过有限稀释的方法获得PK15-IFNAR1-/-单克隆细胞系。酶标仪检测CCK-8处理PK15-WT和PK15-IFNAR1-/-两种细胞后吸光值差异性,确定IFNAR1基因敲除是否影响细胞增殖。荧光显微镜和流式细胞仪检测PRV-GFP在PK15-WT和PK15-IFNAR1-/-两种细胞中荧光强度差异;免疫印迹试验(Western Blot)检测PRV-QXX感染PK15-WT和PK15-IFNAR1-/-两种细胞中gE蛋白表达水平差异;病毒滴度检测PRV-QXX感染PK 15-WT和PK15-IFNAR1-/-两种细胞病毒滴度变化;实时荧光定量PCR检测P测RV-QXX感染PK15-WT和PK15-IFNAR-/-两种细胞干扰素诱导基因15(Interferon Stimulated Gene 15,ISG15)和病毒TK基因mRN转录差异。试验结果表明pIFNAR1-sgRNA重组质粒构建成功。T7酶切鉴定结果表时用武汉质粒在PK15细胞中具有较高的编辑效率。通过对多克隆细胞系进行有限稀释和DNA测序鉴定获理PK15-IFNAR1-/-单克降细胞系。CCK-8增殖检测结果表时,敲除IFNAR1基因不影响细胞增殖。荧光拍照及及流式细胞仪检测结果表明,敲除IFNAR1基因促进PRV-GFP的复制。Western Blot检测结果表明,敲除IFNAR1基因促进PRV-QXX病毒gE蛋白的表达。病毒滴度测定结果表明,敲除IFNAR1基因显著提高病毒滴变。实时荧光定量PCR结果表时,PK15-WT细胞中ISG15基因转录水平随PRV-QXX感染时间延长显著升高,而在PK15-IFNAR1-/-细胞中则无显著变化。病毒TK基因转录水平在PK15-1FNAR1-/-比在PK15-WT细胞中显著上调。综上研究结果表明,成功构建PK15-IFNAR1-/-单克降细胞系,且敲除IFNAR1基因促进PRV复制。本研究为深入研究IFNAR1基因功能提供细胞工具。
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