新型冠状病毒（SARS-CoV-2）造成新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行并严重影响全球公共健康,RBD具有多个抗原表位,是疫苗研究的关键靶点。掌握流行毒株的突变情况并开发安全有效的疫苗,对防控COVID-19具有重要意义。亚单位疫苗具有安全性高,易于生产制备等优点。本研究通过生物信息学分析、原核表达、亲和层析、血清学检测等方法,制备针对SARS-CoV-2的RBD和RBD-Ferritin纳米亚单位疫苗,并对其免疫原性进行初步研究。具体研究内容如下:1.新型冠状病毒RBD基因序列特征分析及原核表达载体构建:SARS-CoV-2原始毒株与Delta、Alpha、Beta、Zeta、Lota、Epsilon、Kappa、Mu、Gamma、Eta变异毒株的RBD进行氨基酸多序列比对,同源性为98.65-99.55%,与三种Omicron变异毒株的同源性为92.82-93.27%。原始毒株与多个变异毒株的RBD位于同一进化树分支并且Motif保守域突变位点少,说明RBD保守性较好。RBD和RBD-Ferritin融合蛋白理化性质分析显示其在常规条件下亲水性较高,二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。根据大肠杆菌密码子使用偏好将RBD的核苷酸序列进行优化并克隆至p ET-28a载体,再通过PCR扩增Ferritin和酶切连接实验,成功构建了p ET-28a-RBD-Ferritin表达载体。2.RBD和RBD-Ferritin融合蛋白的表达、纯化及复性:通过IPTG诱导BL21大肠杆菌表达得到了RBD和RBD-Ferritin融合蛋白,使用SDS-PAGE电泳对其表达形式进行分析。结果显示在包涵体和总蛋白组检测到与预期大小相符的RBD和RBD-Ferritin融合蛋白的条带,Western-blot鉴定显示在25 k Da和41 k Da处有特异性蛋白条带,说明两种蛋白在细菌中主要以包涵体的形式表达。通过Ni2+亲和层析纯化获得了大量高纯度目的蛋白,使用脱盐柱对蛋白进行梯度复性,SDS-PAGE电泳结果显示获得了活性蛋白。纳米粒径结果显示重组蛋白颗粒大小均一,蛋白稳定性结果显示蛋白在25℃保存7天未发生降解。3.RBD-Ferritin纳米亚单位疫苗免疫原性研究:选取36只4周龄的雌性BALB/c小鼠,将纯化获得的RBD和RBD-Ferritin融合蛋白作为抗原,单剂组首次免疫剂量分别为15μg和25μg,佐剂组按1:1比例与氢氧化铝配伍后皮下注射小鼠,后续加强免疫3次,剂量减半。在第1、2、3、4、10周对小鼠进行眼眶静脉采血并分离血清,进行特异性Ig G和Ig M抗体效价检测。结果发现第1周实验组的特异性Ig G和Ig M抗体效价显著高于对照组,前4周的RBD-Ferritin组的Ig G抗体效价均显著高于RBD组,Ig M抗体效价在第2周和第4周差异显著。佐剂组的Ig G抗体效价在第2周和第3周显著高于单剂组,但是添加佐剂不影响Ig M抗体效价。第10周的实验组仍检测到较高滴度的Ig G和Ig M抗体。本研究证明RBD具有良好的稳定性和保守性,RBD和RBD-Ferritin融合蛋白可以在大肠杆菌大量表达,通过亲和层析得到的重组蛋白可以诱导小鼠产生特异性的血清Ig G和Ig M抗体。增加免疫次数可以持续诱导免疫应答,且RBD-Ferritin融合蛋白诱导产生的Ig G效价显著高于RBD蛋白,添加氢氧化铝佐剂可以进一步增强免疫应答。本研究为应用Ferritin纳米笼状结构制备SARS-CoV-2疫苗提供参考,并为研究新型冠状病毒的致病机理及血清学检测等奠定基础。